文献信息
英文题名
Recycling saline wastewater from fish processing industry to produce protein-rich biomass from a Thraustochytrid strain isolated in the Basque Country
作者
Iratxe Urreta, Sonia Suárez-Álvarez, Susana Virgel, Itziar Orozko, Marta Aranguren, Miriam Pinto
期刊 / 年份
Bioresource Technology Reports 2025
DOI
10.1016/j.biteb.2024.102016
卷期 / 页码
29: 102016
单位
西班牙巴斯克农业研究与技术发展研究所（NEIKER-BRTA）植物生产与保护系；NEIKER-BRTA 自然资源保护系
一句话概括：以巴斯克海岸分离的破囊壶菌为对象，先确定氮投加量与盐度的最优点（1.2 g/L N、36 g/L 盐度），再把金枪鱼罐头卤水整合进培养过程，验证其可替代海盐乃至酵母膏，实现高蛋白生物量的低浓度培养基生产。
一图不看也要知道的几件事
- 卤水化学组成：低氮卤水（Brine LN）干物质 10.94±1.05%、蛋白 0.33±0.03%、灰分 9.11%、盐 8.94%、总氨基酸 0.17%、游离氨基酸 0.04%；高氮卤水（Brine HN）干物质 14.7±0.56%、蛋白 3.77±0.04%、灰分 10.07%、盐 9.58%、总氨基酸 1.85%、游离氨基酸 0.54%。
- 氮效应：总氮升至 0.8 g/L 时生物量最大，为 6.2 g/L；超过此值生物量反而下降。蛋白含量在最高氮投加时达最大值 63%（DW），在最低氮投加时下降一半以上。
- 氮投加量至少 0.8 g/L 对生物量与蛋白产量均最优，同时营养去除效率保持 80%；继续增氮可把蛋白含量提高到约 60%（DW）但容积蛋白产量相近，且降低营养去除效率。
- 盐度效应：低氮（0.4 g/L）下生物量随盐度升高而增加，最高 6.4±0.26 g/L；高氮（1.2 g/L）下 36 g/L 盐度使生物量相比同盐度低氮组提高 39%，达 8.93 g DW/L；进一步升到 70 g/L 则对高氮下的生长不利。
- 菌株可在 9–70 g/L 盐度范围内生长，最低盐度下生物量显著下降；高氮下 36 g/L 盐度时容积蛋白产量达峰值 4.34 g/L。
- 高氮下整个盐度范围内 C/N 比不受盐度影响、蛋白含量稳定在 50% DW；低氮下 C/N 比随盐度升高而升高、蛋白含量下降。
- 以 HN 卤水培养（不外加酵母膏）168 h 得 5.53±0.15 g DW/L，产率 0.79±0.02 gDW/L/d，蛋白 2.79±0.1 g/L、蛋白含量 50.72%（DW）、氮含量 8.12%（DW）；对照为 8.10±0.29 g DW/L、蛋白 3.17±0.11 g/L、蛋白含量 39.09%（DW）。
- 以 LN 卤水替代海盐：96 h 得 7.37±0.08 g DW/L、蛋白 3.67±0.04 g/L、氮含量 7.97%（DW）、蛋白含量 49.81%（DW），TAA 去除率 83.21±0.98%。
- 成本：以 LN 卤水替代海盐把培养基成本降到 1 €/L、节省 26%；在 HN 卤水中去除酵母膏（改用卤水作氮源）使总成本降低 93%、达 90 €/m³，按单位生物量成本计改善 88%；若按 Wang et al.(2020) 的葡萄糖价格，产 1 kg 生物量成本为 1.35 €，较分析纯葡萄糖配方降低 90% 以上。
- 整合卤水可节省 37–40% 淡水，因菌株能耐更高盐度，该比例有望提高到 73%。
- 单缺省实验：HN 卤水中去除磷酸盐与维生素对生物量无影响；去除金属元素使生物量显著下降 30%。
研究背景与要解决的问题
面对水资源紧张与工业活动环境影响，高效废水处理日益关键。鱼罐头行业产生大量成分多变的废水，通常含大量有机物（主要是蛋白与油脂）以及高浓度氯化物，使常规物化处理难以奏效；巴斯克地区金枪鱼罐头厂每年排放超过 40 万 m³ 废水（加工 4.2 万 t 鱼）。
除法规约束外，基于再利用与增值的可持续废物管理也是企业落实循环经济的要求。用微生物或酶把废水中有机物转化为高值生物产品的生物处理受到关注，但高盐度是主要限制因素，因为盐会抑制许多生物系统的活性。
用耐盐且具天然蛋白水解活性的微生物处理含盐废水因此成为机会。破囊壶菌是海洋真核单细胞微生物，能产生多种水解酶、参与有机物分解与再矿化，是 DHA 等油脂的著名非动物工业来源，近年也被关注为蛋白、酶、角鲨烯、胞外多糖、色素的潜在生产者。
已有研究显示破囊壶菌蛋白具有热稳定性与适合功能食品的氨基酸谱和益生特性，但其蛋白含量多在 30–38%（DW）；迄今没有报道描述破囊壶菌在何种条件下积累蛋白，也没有以产蛋白为目标的工艺。
概念与技术边界
破囊壶菌（thraustochytrids）
一类海洋真核单细胞微生物，能分泌多种水解酶分解有机物，也是 DHA 等油脂的重要工业来源，近年被认为可产蛋白等更多高值分子。
卤水（brine）
鱼罐头蒸煮工序后得到的煮汁，含较高盐分与蛋白/氨基酸等有机物，直接排放难处理，此处作为培养用盐度与营养来源。
HN / LN 卤水
按蛋白与总氨基酸含量区分的"高氮卤水"与"低氮卤水"，源于不同蒸煮工艺（配方）。
单缺省法（single-omission）
在基础培养基中逐一去掉某一组分（磷酸盐、维生素、金属），观察其对生长的影响，以此判断该组分是否必需。
TAA / FAA
总氨基酸与游离氨基酸；FAA 更易被直接吸收，是菌株的优选氮源。
蛋白酶活性
培养基上以脱脂奶粉为底物形成水解圈，指示菌株分泌胞外蛋白酶的能力。
体系与方法
| 环节 | 做法与参数 |
|---|---|
| 卤水采集 | 2021 年 5 月自 Bizkaia 金枪鱼罐头企业的蒸煮锅直接采集金枪鱼蒸煮后的煮汁（卤水），原样倾倒、储存于 −18℃，理化表征由 AZTI 完成；按蛋白与总氨基酸含量分为低氮（LN）与高氮（HN）卤水。 |
| 菌株分离与鉴定 | 用花粉诱饵法自 Pobeña 湿地（43°20′44″N；3°7′22″W）样品分离菌株 Pob2.4，海盐溶液 20–30 g/L 盐度并加制霉菌素、青霉素 G、链霉素；取附着微生物的花粉粒涂布 790By+ 固体培养基，22℃ 培养；光镜（Nikon Eclipse 80i）与数码显微镜（LEICA DMS1000）观察形态。 |
| 分子鉴定 | 取约 100 mg 鲜菌体，DNeasy Plant Mini Kit 提取 DNA；用真核通用引物扩增 18S rRNA 约 700 bp 区段（94℃ 4 min，35 循环 94℃ 30 s/56℃ 30 s/72℃ 1 min，终延伸 72℃ 5 min）；BLAST 比对并以 MEGA11 构建最大似然树（Tamura-Nei 模型），以 Prorocentrum arenarium（Y16234.1）为外群。 |
| 培养条件 | 标准培养基于葡萄糖 15 g/L、酵母膏 2 g/L、蛋白胨 2 g/L、海盐 18 g/L，pH 6±0.2；24℃、140 rpm、黑暗、每周继代一次。 |
| 氮效应实验 | 基础培养基葡萄糖 15 g/L、KH₂PO₄ 0.4 g/L、海盐 18 g/L；酵母膏与蛋白胨 1:1（w/w）提供 0.4、0.8、1.2、1.6 g/L 四个总氮浓度；pH 6±0.2，121℃ 20 min 灭菌，微量元素与维生素过滤除菌后加入；接种量 10%（v/v），200 mL 摇瓶装 50 mL，培养 96 h，每组两个重复。 |
| 盐度实验 | 两轮实验：第一轮在 0.4 g/L 氮（酵母膏+蛋白胨）下加 4.5、9、18、36 g/L 海盐；第二轮在优化氮浓度 1.2 g/L 下评估 36、45、50、70 g/L 盐度；每组三个重复，10%（v/v）接种、200 mL 摇瓶装 50 mL、96 h。 |
| 卤水整合实验 | LN 卤水仅用于提供盐度（稀释到 36 g/L 盐度，替代商品海盐），补加葡萄糖 15 g/L、KH₂PO₄ 0.4 g/L、金属液 1 mL/L、维生素液 1 mL/L，并以酵母膏提供 1.2 g/L 总氮；HN 卤水因蛋白与 FAA 高，同时替代盐度与氮源（不外加酵母膏，假设其蛋白与 TAA 可作有机氮源）。对照为海盐+葡萄糖 15 g/L+酵母膏 1.2 g/L 总氮+KH₂PO₄+金属+维生素。培养至生长进入稳定期，三重复、10%（v/v）接种、200 mL 摇瓶装 50 mL。 |
| 过程简化与成本分析 | 用单缺省法在 HN 卤水培养基中分别去除 KH₂PO₄、维生素、金属；以完整配方为各自对照。成本评估仅基于培养基组分成本，采用 Duchefa、Sigma、Panreac 分析纯试剂与 2023 年价格。 |
| 分析方法 | 生长用重量法（13,300 rpm 10 min 离心、洗菌、冻干称重，g DW/L）；葡萄糖用 3,5-二硝基水杨酸法；总氨基酸用茚三酮法（L-赖氨酸标准）；蛋白用 Lowry 法（BSA 标准）；游离氨基酸用 HPLC（Agilent 1260 Infinity II，OPA/FMOC 衍生，Advanced Bio AAA 柱，338/262 nm）；总碳氮用 LECO CN828 元素分析仪（950℃ 燃烧，NDIR 测碳、热导测氮），蛋白含量按氮×6.25 估算；蛋白酶活性用 0.5% 脱脂奶粉 790By+ 平板 22℃ 培养 6 天测水解圈。 |
| 统计分析 | 对 2.3.2 第二轮容积蛋白含量与 2.3.4 生物量做单因素方差分析并结合 Tukey 多重比较；p<0.05 为显著；正态性与方差齐性分别用 Shapiro-Wilk 与 Levene 检验；使用 R 软件。 |
主要结果（原文图表逐条解读）
图示信息：九联显微照片 A–I，含琼脂平板菌落巨观照、光镜下的细胞团簇、厚壁细胞/囊胞、内质网、释放孢子的孢子囊、带鞭毛的游动孢子，以及尼罗红染色的荧光脂滴图；标尺从 5 mm 到 5–25 μm 不等。
论文结果：菌落边界清晰、无蔓延、呈强烈橙色、质地柔软；细胞球形、直径 5–50 μm，大小差异大并有聚集倾向；随培养变老形成厚壁，可见内质网；游动孢子双鞭毛、异型（不等长），形状卵形至肾形；孢子囊壁逐渐崩解或形成壳盖释放大量游动孢子；尼罗红染色显示脂质以多个球状油滴积累。
研究意义：确立分离株属破囊壶菌的典型形态与生活史（营养细胞—囊胞—游动孢子），并证实其具备脂质积累能力，为后续培养与产蛋白评价提供菌种基础。
图示信息：最大似然系统发育树，将菌株 Pob2.4 与 NCBI GenBank 中的近缘种比对，以 Prorocentrum arenarium（Y16234.1）为外群。
论文结果：获得约 700 bp 的 18S rRNA 部分序列，BLAST 显示与已提交的破囊壶菌序列相似度在 88.11–96.43% 之间，与 Thraustochytrium striatum 的不同登录号（KT598545.1、OP177678.1、AB022112.1）相似度最高；系统发育树证实该菌株与 Thraustochytrium 分离株亲缘相近，确认其属于 Thraustochytriaceae 科。
研究意义：明确分离株的分类地位（破囊壶菌科），为后续以其作为高盐废水资源化菌株的结论提供物种依据。因原图未提取，仅作文字解读。
图示信息：四联图，(A) 容积生物量与蛋白（g/L）、(B) 生物量 C/N 比、(C) 蛋白含量（%DW）、(D) 营养去除效率，均以总氮浓度（0.4–1.6 g/L）为处理变量。
论文结果：生物量随总氮升高至 0.8 g/L 时达最大 6.2 g/L，超过后下降（A）；生物量 C/N 比随培养基总氮增加而下降（B）；蛋白含量在最高氮投加时达最大 63% DW，在最低氮投加时下降一半以上（C）；容积蛋白产量除最低氮水平明显下降外基本不受氮投加影响（A）；低氮下葡萄糖与氨基酸被完全消耗（D）。
研究意义：确立"氮投加量至少 0.8 g/L"对生物量与蛋白产量双优、同时保持 80% 营养去除效率；低于 0.8 g/L 会因高 C/N 造成营养失衡与氮限制、把碳流导向脂质合成，从而降低生长与蛋白含量。这是首次系统描述破囊壶菌产蛋白所需的培养条件。
图示信息：四联图，处理为盐度（低氮下 4.5/9/18/36 g/L，高氮下 36/45/50/70 g/L），指标同 Fig. 3。
论文结果：低氮下生物量随盐度升高而增加，最高 6.4±0.26 g/L；高氮下 36 g/L 盐度使生物量比同盐度低氮组提高 39%、达 8.93 g DW/L，盐度继续升至 70 g/L 则对高氮下生长不利（A）。低氮下生物量 C/N 比随盐度升高而升高、蛋白含量随之下降；高氮下 C/N 比不受盐度影响，全盐度范围蛋白含量稳定在 50% DW（B、C）。容积蛋白产量在高氮下提高，在 36 g/L 盐度达峰 4.34 g/L（A）。低氮且盐度高于 18 g/L 时 TAA 被 100% 去除；高氮下 TAA 去除率约 80%，葡萄糖去除率从 93%（36 g/L）降至 62%（70 g/L）（D）。
研究意义：给出后续工艺的"1.2 g/L 氮 + 36 g/L 盐度"最优点：既提高蛋白产量（峰值 4.34 g/L）又实现 TAA 高效去除（88%）；并证实该菌株能耐 70 g/L 高盐，为处理鱼罐头行业高盐废水打开可能。
图示信息：列出 Brine LN 与 Brine HN 的干物质、蛋白、灰分、盐、总氨基酸、游离氨基酸含量（% w/v）。
论文结果：Brine LN：干物质 10.94±1.05%、蛋白 0.33±0.03%、灰分 9.11±0.04%、盐 8.94±0.09%、总氨基酸 0.17±0.00%、游离氨基酸 0.04±0.00%；Brine HN：干物质 14.7±0.56%、蛋白 3.77±0.04%、灰分 10.07±0.03%、盐 9.58±0.23%、总氨基酸 1.85±0.00%、游离氨基酸 0.54±0.05%。
研究意义：量化两类卤水的差异（源于不同蒸煮工艺），决定 LN 卤水仅作盐度来源、HN 卤水可兼作氮源的分工。
图示信息：比较 Control、Brine LN、Brine HN 三组在最大生物量时间、生物量、产率、蛋白、氮含量、蛋白含量、葡萄糖去除率、TAA 去除率上的数值。
论文结果：Control：96 h、8.10±0.29 gDW/L、2.03±0.03 gDW/L/d、蛋白 3.17±0.11 g/L、N 6.26±0.02% DW、蛋白 39.09±0.13% DW、葡萄糖去除 92.88±0.02%、TAA 去除 85.97±0.39%。Brine LN：96 h、7.37±0.08 gDW/L、1.84±0.01 gDW/L/d、蛋白 3.67±0.04 g/L、N 7.97±0.00% DW、蛋白 49.81±0.00% DW、葡萄糖去除 95.06±0.25%、TAA 去除 83.21±0.98%。Brine HN：168 h、5.53±0.15 gDW/L、0.79±0.02 gDW/L/d、蛋白 2.79±0.1 g/L、N 8.12±0.01% DW、蛋白 50.72±0.04% DW、葡萄糖去除 95.51±0.20%、TAA 去除 42.52±2.59%。
研究意义：LN 卤水替代海盐在产量与营养去除上均无不良影响，且卤水带来的额外有机氮提高了生物量氮含量；HN 卤水可省去酵母膏并使蛋白含量比对照高 30%，但因生物量更低、周期更长而降低产率，且 TAA 去除效率相比对照下降约 50%，说明卤水有机氮不如酵母膏易于同化。
图示信息：汇总不同含盐废弃物（马苏里拉拉伸水、干酪乳清盐水、腐乳与豆腐乳清废水、鳕鱼厂卤水、鲱鱼加工卤水、贻贝煮水、金枪鱼煮水）所用微生物、干生物量产量与目标产物及文献。
论文结果：马苏里拉拉伸水+Aurantiochytrium mangrovei：3.63–10.14 g/L，DHA 1.21 g/L；干酪乳清盐水+Schizochytrium limacinum PA-968、Japonochytrium marinum AN-4：13.8–23.3 与 11.1–18.92 g/L，脂质 47% DW（DHA 0.33 g/L/d）与 57% DW（DHA 0.29 g/L/d）；豆腐乳清废水+Schizochytrium sp. S31：19.08 g/L，DHA 2.66 g/L；鳕鱼厂卤水+Jarrowia lipolytica：14.7 g/L，油酸占油 60%；鲱鱼加工卤水+Aspergillus oryzae：4.1 g/L，蛋白 600 g/kg；贻贝煮水+混合菌群：4.2 g aVSS/L，PHA 8.8–41.5%；本研究 tuna cooking water+Thraustochytrium sp. (Pob2.4)：5.5–7.3 g/L，蛋白 50%DW。
研究意义：本研究的生物量处于破囊壶菌类报道的偏低区间，但此前研究多以脂质与 DHA 为目标、需 50–70 g/L 高碳浓度，故其生物量偏高；本研究是首个以产蛋白为目标、且蛋白含量达 50%DW 的案例。
图示信息：比较以海盐为基准的培养基与用卤水替代海盐/氮源后的成本。
论文结果：以 LN 卤水替代海盐把培养基成本降至 1 €/L，节省 26%（该配方仍含酵母膏，单位生物量成本很高）；在 HN 卤水配方中去除酵母膏使总成本降低 93%、为 90 €/m³，按单位生物量成本计改善 88%。若按 Wang et al.(2020) 的葡萄糖价格，产 1 kg 生物量成本为 1.35 €，较优化 HN 卤水+分析纯葡萄糖配方降低 90% 以上。
研究意义：表明以卤水简化培养基带来的成本下降可以补偿 HN 卤水导致的生物量产率下降；并指出使用食品级、大批量采购原料可进一步降低价格。
图示信息：两组时间曲线，(A) 生物量与葡萄糖随 0–168 h 变化；(B) 总可溶蛋白、TAA、FAA 与蛋白酶活性随时间的动态。
论文结果：生物量逐渐增加直至 168 h 葡萄糖耗尽（A）；同期 TAA 下降 40%、FAA 被完全消耗（B）；可溶蛋白在 96 h 前保持稳定、之后开始下降，同时 TAA 急剧上升且未转化为生物量；蛋白酶活性随 TAA 上升而出现并逐渐增强。
研究意义：FAA 被优先利用、是菌株偏好的氮源；可溶蛋白下降伴随 TAA 上升且不转化为生物量，说明菌株缺乏摄取小肽的能力（或 168 h 碳源耗尽阻碍了肽的同化），蛋白酶很可能是内切酶、只释放蛋白片段或小肽而非 FAA；提示 HN 卤水工艺存在提产空间。
图示信息：以对照、去磷酸盐（no PO4）、去维生素（no vit）、去金属（no met）四组比较生物量。
论文结果：去除磷酸盐与去除维生素的培养行为与对照一致；其生物量氮含量分别为 9.10%±0.04 与 8.82%±0.02，仍保持富氮。去除金属使生物量显著下降 30%。
研究意义：使用 HN 卤水时无需另行添加磷酸盐与维生素（卤水本身提供该菌所需维生素），但微量元素不可或缺；所用金属混合液不含铁，而卤水中铁也不显著，补铁或可进一步提升生长。
机制小结
- 氮调控蛋白积累：氮充足时碳流进入生长与蛋白合成，C/N 比下降、蛋白含量升高；氮限制时菌株把碳导向脂质合成（诱导脂质生成），从而降低生长与蛋白含量。
- 盐度与氮协同：蛋白积累仅在氮限制时与盐度呈负相关；氮充足时 C/N 比与蛋白含量在全盐度范围保持稳定（50% DW），说明氮供给是蛋白含量的主导因子。
- 氮源偏好与同化：FAA 优先被消耗；可溶蛋白先稳定后下降而 TAA 上升，提示菌株分泌内切型胞外蛋白酶，把蛋白水解为小肽/片段但难以进一步吸收，故 TAA 未转化为生物量。
- 卤水作为营养库：卤水提供氨基酸、维生素与磷酸盐，可直接替代海盐（盐度）和部分氮源；其有机氮的同化效率低于酵母膏，是 TAA 去除率下降与产率降低的原因。
工程与产业含义
- 盐度与氮配方：破囊壶菌产蛋白的推荐条件为总氮约 1.2 g/L、盐度约 36 g/L，可在提高蛋白产量（峰值 4.34 g/L）的同时保持较高 TAA 去除（88%）。
- 介质简化路线：以 LN 卤水替代商品海盐（至 36 g/L 盐度）不损失产量与营养去除，还可省水；以 HN 卤水同时替代盐度与氮源可省去酵母膏，使培养基成本降低 93%、单位生物量成本降低 88%。
- 节水：整合卤水可节省 37–40% 淡水；因菌株能耐 70 g/L 盐度，该比例有望提高到 73%。
- 成本权衡：HN 卤水路线虽更便宜，但生物量更低、周期更长（168 h vs 96 h），需在产率与成本之间取舍；使用食品级原料、大批量采购与更廉价的碳源（如果渣、马铃薯皮淀粉、玉米糖浆）可进一步降本。
- 与行业结合：把鱼罐头行业难处理的含盐侧流引入培养过程，可减少其环境负荷并为行业提供一条处置出路。
适用与不适用场景
✅ 适用场景
- 鱼罐头/鱼类加工行业的高盐蒸煮卤水（含盐度可达 70 g/L）的资源化利用与前处理。
- 以破囊壶菌为底盘生产富蛋白生物量、面向食品/饲料用替代蛋白的场景。
- 需要降低培养基成本、减少淡水消耗的海洋微生物发酵与水产饲料原料生产。
- 需要同时评估营养去除（TAA、葡萄糖）效率的废水增值工艺。
⚠️ 不适用 / 需谨慎
- 需要与对照相同或更高生物量产率的场景：HN 卤水路线的生物量（5.53 g DW/L）与产率（0.79 gDW/L/d）明显低于对照。
- 以最大 TAA 去除为目标的场景：HN 卤水路线 TAA 去除率仅约 42.5%，远低于对照的 86%。
- 要求有机氮高效同化的工艺：卤水有机氮不同于酵母膏，不易同化；若需提高需先对 HN 卤水做蛋白水解，但商业酶会带来成本。
- 直接外推到其他盐度/废水类型：菌株响应受分离生境影响，结论针对本菌株 Pob2.4。
局限与不确定性
作者未解决 / 需要读者注意的问题
- 成本评估仅基于分析纯试剂与 2023 年价格，且只计算培养基组分成本，未涵盖下游收获、破碎与纯化等环节。
- HN 卤水路线生物量更低、周期更长，且 TAA 去除率显著下降，作者明确指出该路线"产率较低"。
- 蛋白酶为定性测定（脱脂奶粉平板水解圈），未做酶学表征或鉴定具体酶种。
- 研究在摇瓶（50 mL/200 mL）水平进行，未在反应器或更大规模验证。
- 氮与盐度实验均以酵母膏+蛋白胨为氮源，与真实卤水的有机氮形态仍有差异。
- 文中声明"No data was used for the research described in the article"。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性：声明"No data was used for the research described in the article"。经费：欧盟 Horizon 2020 研究创新计划 Sea2Land 项目（资助协议号 101000402）。利益冲突：作者声明无。致谢：AZTI 的 Carlos Bald 及研究团队提供卤水化学分析。
来源与链接
- ScienceDirect 原文 — https://doi.org/10.1016/j.biteb.2024.102016