文献信息
英文题名
Valorization of food waste fermentation liquid into single cell protein by photosynthetic bacteria via stimulating carbon metabolic pathway and environmental behaviour
作者
Zizeng Zhu, Yang Wu, Wanying Hu, Xiong Zheng, Yinguang Chen
期刊 / 年份
Bioresource Technology 2022
DOI
10.1016/j.biortech.2022.127704
卷期 / 页码
Volume 361, Article 127704
单位
同济大学环境科学与工程学院污染控制与资源化研究国家重点实验室（上海200092）；上海市污染控制与生态安全研究院
一句话概括：研究以 Rhodobacter capsulatus 为对象，用不同稀释度的餐厨垃圾发酵液替代合成培养基培养72 h，测定SCP产量、生长、活性、VFAs利用与转录组，阐明碳源水平如何通过碳代谢通路与环境行为共同决定SCP合成。
一图不看也要知道的几件事
- 所用菌株为紫色非硫细菌 Rhodobacter capsulatus（CGMCC 1.3366），活化培养基为112 Van Niel's Yeast Agar（含1.0 g/L K2HPO4、10.0 g/L酵母提取物、0.5 g/L MgSO4），30℃、160 rpm、白炽灯培养5天活化。
- 餐厨垃圾为上海某可再生能源利用中心提供的富碳水化合物餐厨垃圾，预处理后（破碎、提油、除杂）主要成分为每100 g含碳水化合物5.94±0.27 g、蛋白2.51±0.14 g、脂质2.12±0.11 g。
- 发酵液经13416×g离心10 min、0.22 µm PVDF过滤并调pH至8；主要成分：溶解性COD 42300±1250 mg/L，总氮1317±50 mg/L，氨氮1031±48 mg/L，总磷10.3±0.4 mg/L，溶解性蛋白2694±125 mg/L，溶解性多糖402±21 mg/L，总VFAs 32440±1035 mg COD/L；VFAs由乙酸27.9%、丙酸5.3%、丁酸41.6%、戊酸25.2%组成。
- 发酵液按体积稀释为0%（对照）、10%、20%、40%四组，每瓶装42.5 mL稀释液加7.5 mL活化菌液（接种比15% v/v），高纯氮气（99.9%）吹扫5 min后密封，30℃、160 rpm、白炽灯培养72 h；每12 h取样2 mL测生长曲线与COD/VFAs，24 h与72 h分别测细胞活性与SCP干重，每组3平行。
- SCP产量：对照397.2 mg/L；10%为1124.3 mg/L（对照2.8倍）；20%为2088.4 mg/L（对照5.3倍，最高）；40%回落至1566.7 mg/L，显示抑制效应。
- 生物转化率（生物量产/COD消耗）在20%时最高（0.99 mg biomass/mg COD），与文献中个体及混合VFAs底物的0.9–1.1 g CODBiomass/g CODRemoved一致；40%时降至0.69 mg biomass/mg COD。
- 生长（72 h OD600）：10%为1.3、20%为1.6；40%生长受抑（原文称OD600在40%时被抑制，Fig. 1显示其初期延滞、后段仍上升）。
- 相对细胞活性：10%与20%分别提高至对照的260.6%与396.1%；40%较20%由396.1%降至312.6%。
- VFAs/COD消耗比：10%为69.6%、20%为87.2%、40%降为78.3%；消耗VFAs中乙酸占比54.8–67.6%，丁酸17.1–25.3%，丙酸7.9–9.2%。
- 碳代谢基因相对丰度：acs提高373.1%；ackA为过量组的1.6倍；accA提高141.8%；atoB与fadN分别为最优组的3.4与1.7倍。
- TCA相关基因在过量组下调：sdhA下降15.2%，pdhA下降68.1%。
- 过量与最优相比共鉴定1287个差异表达基因（291上调、996下调），下调基因显著富集于膜/跨膜转运与金属离子、DNA、ATP结合等GO条目。
- 环境行为相关基因（最优组 vs 过量组）：pufX为3309.2 vs 2806.7 TPM，pufL为1972.3 vs 1378.1 TPM；过量组regA为66.86 TPM（约为最优组一半）；livG在最优组高4.2倍；过量组secA降低28.9%；cbiM、cbiQ在过量组分别下调44.4%与40.7%；proX、proV、proW在最优组分别提高33.1%、2.6%、54.6%。
研究背景与要解决的问题
全球人口预计2050年达80–100亿，蛋白需求在2020年已超过2.5亿吨。现有可食蛋白主要来自植物与动物，生长周期长且生产易造成环境污染。单细胞蛋白（SCP）由单细胞生物培养获得，蛋白转化效率高，含维生素、碳水化合物、脂质、矿物质、酶等活性物质，且生产不受气候与土地限制，欧盟已同意将SCP用于牲畜与动物饲料，因此SCP生产对缓解全球粮食危机与可持续性发展具有重要意义。
光合细菌（PSB）富含蛋白、代谢能力丰富，既可用于污水处理去除染料、重金属、微污染物，也可产柴油与氢气等高值副产物；已有研究显示PSB的SCP合成效率较高（蛋白含量>60%、蛋白产率约150 mg/L·d）。但碳源成本已成为实际SCP生产的瓶颈，迫切需要降低。
与此同时餐厨垃圾（FW）产量快速增加，厌氧发酵产挥发性脂肪酸（VFAs）是绿色有效的处置方式，VFAs市场年规模超15000千吨、价约1500欧元/吨。然而发酵液中碳组分复杂，可能限制其高值利用；目前研究多关注单一碳源对SCP生产的影响，发酵液作碳源会如何影响PSB的SCP合成尚无定论，碳源调控下的碳代谢通路与环境行为变化也需进一步研究。
概念与技术边界
SCP（单细胞蛋白）
通过培养单细胞微生物获得的蛋白，可作饲料蛋白替代品，生产不受气候与耕地限制。
VFAs（挥发性脂肪酸）
餐厨垃圾厌氧发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等小分子有机酸，是PSB易于利用的碳源。
乙酰-CoA
细胞代谢的核心前体，乙酸可直接转化为它，丙酸与丁酸则需经多步转化才能生成。
TCA循环
三羧酸循环，既为微生物生长供能，也提供蛋白合成所需的前体物质。
环境行为
微生物为适应外部刺激而调节的行为与系统，本研究涉及双组分系统（TCS）、群体感应（QS）与ABC转运蛋白等。
TPM
每百万转录本数，一种基因表达水平定量指标，用RNA测序计算。
体系与方法
| 环节 | 做法与参数 |
|---|---|
| 菌株与培养 | Rhodobacter capsulatus（CGMCC 1.3366）以112 Van Niel's Yeast Agar活化，30℃、160 rpm、白炽灯培养5天备用。 |
| 底物与发酵液预处理 | 餐厨垃圾发酵液先13416×g离心10 min，上清经0.22 µm PVDF过滤，用1 M HCl/NaOH调pH至8；再以超纯水按体积稀释为0%、10%、20%、40%。 |
| SCP生产实验 | 100 mL工作体积血清瓶中装42.5 mL稀释发酵液与7.5 mL活化菌液（15% v/v接种比），高纯氮气吹扫5 min密封，30℃、160 rpm、白炽灯培养72 h；每12 h取样2 mL测生长与COD/VFAs，24 h测细胞活性、72 h测SCP干重，结束取2 mL于−80℃保存供检测。 |
| SCP干重测定 | 离心管60℃预热2 h并称重，取6 mL样品13416×g离心5 min去上清，0.1 M PBS重悬后再离心，重复三次，60℃烘至恒重称量。 |
| VFAs与COD测定 | COD按重铬酸钾法用HACH DRB200测定；VFAs用气相色谱（Agilent 7820）测定，样品离心、0.45 µm过滤后用超纯水与3% H3PO4稀释至pH<3.0、浓度40–200 mg/L范围内上机。 |
| 细胞活性与生长测定 | 活性用CCK-8法，离心、PBS洗三次、30 mM Tris HCl重悬，100 µL样品加100 µL CCK-8试剂30℃孵育30 min，双波长（450与600 nm）测定；生长以OD600表征（离心去上清、PBS洗三次后测600 nm吸光）。 |
| 转录组测序 | 取24 h菌体2716×g、4℃离心10 min，TRIzol提取总RNA，riboZero去rRNA，Truseq RNA sample prep Kit片段化并合成cDNA，Illumina Hiseq 4000测序；Sickle与SeqPrep过滤，以TPM计算表达量，EdgeR比较差异表达，GO与KEGG注释。 |
| 统计分析 | 所有试验做三次平行，方差分析检验显著性，p<0.05为显著。 |
主要结果（原文图表逐条解读）
图示信息：由三部分构成：左上“PSB生长”示意菌体增殖并给出对照约400 mg/L与最优约2100 mg/L的SCP产量对比柱；左下“刺激环境行为”示意ABC转运蛋白、氨基酸转运、Co²⁺转运、群体感应（livG/recA）与双组分系统（OmpR/EnvZ）以及光合机构（RC-LH1、pufAB、petABC、ATP合酶）；右侧“改善碳代谢通路”的细胞代谢图，乙酸、丙酸、丁酸经乙酰-CoA等中间体进入TCA循环，各基因/酶旁标注绿色至黄色（0–300标尺）的数值，末端CO2与ATP汇入SCP。
论文结果：概括出碳源调控提升SCP的三条主线：增强菌体生长（产量由对照约400提升至约2100 mg/L）、激活环境行为、改善碳代谢通路。
研究意义：以示意图形式说明本研究“碳代谢通路+环境行为”双调控的总体逻辑；作为摘要图不含新的定量数据，具体数值以正文与各图为准。
图示信息：以时间为横轴（0–72 h）、OD600为纵轴的生长曲线，含四条带误差棒的曲线：对照（红线方块）、10%（蓝圆圈）、20%（黄色上三角）、40%（绿色下三角）。
论文结果：对照生长明显低于各加发酵液组（24–60 h平台约0.7–0.75）；10%在36 h达峰约1.45–1.5 后回落至72 h约1.25；20%生长最强、约48 h达峰约1.75、72 h约1.65；40%初期延滞（24 h仅约0.55）后持续上升至72 h约1.6。正文给出72 h OD600为10%时1.3、20%时1.6。
研究意义：说明发酵液的存在有利于PSB生长，碳源水平由10%升至20%时生长相应增强，而40%高碳源负荷对生长不利（正文称生长受抑）；曲线读值为图形估读，正文以72 h的OD600读数为准。
图示信息：堆叠柱状图，横轴为发酵液水平（10%、20%、40%，v/v），纵轴为消耗VFAs占比（%），分为乙酸（蓝）、丙酸（黄）、丁酸（绿）、戊酸（紫）四段。
论文结果：乙酸为各水平下占比最大的组分（10%约54%、20%约68%、40%约66%）；丁酸次之（10%约25%、20%与40%约18–19%）；丙酸约7–9%；戊酸最小（10%约12%、20%约6%、40%约8%）。正文给出乙酸占54.8–67.6%、丁酸17.1–25.3%、丙酸7.9–9.2%。
研究意义：说明PSB优先利用发酵液中的VFAs，且以乙酸最易利用；由10%升至20%时乙酸占比明显升高，反映更高碳源水平下乙酸被优先消耗的倾向；柱高读值为图形估读。
图示信息：细胞代谢示意图：乙酸（左）、丙酸（上）、丁酸（右）经膜进入细胞并汇入乙酰-CoA（中心白椭圆），丙酸经丙酰-CoA（mcr、mmsA）与丙二酸半醛、丙二酰-CoA，丁酸经丁酰-CoA与乙酰乙酰-CoA（atoA/atoB/atoD、fadN、paaH），乙酸经乙酰磷酸（ackA、pta、acs）进入；乙酰-CoA与草酰乙酸进入TCA循环（柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸→草酰琥珀酸→α-酮戊二酸→琥珀酰-CoA→琥珀酸→延胡索酸→苹果酸→草酰乙酸）；各基因/酶名旁配数值色块，标尺由0（青）经黄至500（绿）；底部CO2经蓝色箭头汇入红色SCP椭圆，绿色类囊体膜将ADP+Pi转为ATP供SCP。
论文结果：与最优碳源调控（20%）相比，过量碳源（40%）下乙酰-CoA生成相关基因普遍更低：acs提高373.1%、ackA为过量组1.6倍、accA提高141.8%、atoB与fadN分别为最优组3.4与1.7倍；TCA循环关键基因在过量组下调，sdhA下降15.2%、pdhA下降68.1%。
研究意义：说明过量碳源抑制了VFAs向乙酰-CoA的转化与TCA循环，前者减少SCP合成的核心前体、后者削弱供能与前体供给，是SCP产量下降的代谢层面原因；结果基于转录水平，未做酶活或代谢物通量验证。
图示信息：A为火山图，横轴为Log2折叠变化（约−5至+7.5）、纵轴为−Log10校正P值（0–300），灰点为不显著、红点为上调、绿点为下调；B为下调基因的GO富集条形图（纵轴为下调基因数0–180），按生物过程（蓝）、细胞组分（黄）、分子功能（绿）三类分组。
论文结果：共鉴定1287个差异表达基因，其中291个上调、996个下调。下调基因的GO富集显示：生物过程包括跨膜转运、DNA模板转录调控、固氮、磷酸中继信号转导、信号转导；细胞组分中“膜的内在组分”最大（约150个基因），其后为质膜（约60）、细胞质（约28）与ABC转运蛋白复合物（约12）；分子功能包括金属离子结合、DNA结合、ATP结合、水解酶活性、转移酶活性、DNA结合转录因子活性、氧化还原酶活性、跨膜转运蛋白活性、4铁-4硫簇结合、铁硫簇结合与序列特异性DNA结合。
研究意义：表明过量碳源显著抑制微生物代谢活动，下调基因高度集中于膜与跨膜转运及金属离子、DNA、ATP结合等条目，可解释SCP生物合成的减少；GO富集仅反映功能类别的基因计数，不直接等同于通路活性下降幅度。
图示信息：A为细菌细胞示意：外膜上有ABC转运蛋白（含Co/Ni转运cbiMQ、渗透胁迫相关proXVW）、群体感应/氨基酸转运组分（livG、secA），胞内含核区、核糖体与双组分系统（regA、pufXL、pufAB），右侧为光下由H+梯度驱动ATP合酶的光合机构（RC-LH1）；B为环状热图，比较最优与过量条件下的基因表达（TPM，标尺由蓝约0至红约3500），外围标注pufM、pufX、pufL、regB、regA、puhA、cbiL/Q/O/M/K、proW/X/V、secA/B/Y、livG、degP、dctB、chvI、cydD、trpG、ftsY、yajC、ribA、hyaC、mlaD等基因，附双组分系统/群体感应/ABC转运蛋白三类图例。
论文结果：最优组相对过量组的表达：pufX与pufL分别为3309.2与1972.3 TPM（过量组降至2806.7与1378.1 TPM）；过量组regA为66.86 TPM，约为最优组一半；livG在最优组高4.2倍；过量组secA降低28.9%；过量组cbiM与cbiQ分别下调44.4%与40.7%；最优组proX、proV、proW分别提高33.1%、2.6%、54.6%。
研究意义：说明过量碳源削弱PSB的光合生长能力与磷酸化过程（puf、regA相关），并抑制氨基酸转运与Sec蛋白分泌、Ni/Co微量元素转运以及甘氨酸甜菜碱/PruU介导的渗透胁迫耐受，共同导致菌体活性与SCP产量下降；该图以TPM呈现单一时期（24 h）表达，不能反映表达的时间动态。
机制小结
- 乙酸可直接转化为乙酰-CoA，丙酸须先转丙酰-CoA再脱羧生成乙酰-CoA，丁酸须先氧化为丁酰-CoA与乙酰乙酰-CoA再裂解为乙酰-CoA，故乙酸利用效率最高；乙酸还可作为共底物提高丙酸与丁酸的摄取速率，这解释了其占据消耗VFAs主体的现象。
- 乙酰-CoA进入TCA循环既为生长供能又提供SCP合成前体；过量碳源抑制乙酰-CoA的生成（acs、ackA、accA、atoB、fadN表达降低）并下调TCA关键基因（sdhA、pdhA），从供能与前体两方面限制SCP合成。
- 双组分系统（TCS）中Puf蛋白构成RC-LH1复合体、影响PSB光合能力；regA编码的RegA蛋白具多个磷酸化位点，过量碳源下其表达近半，抑制磷酸化过程，从而削弱PSB把光能转为化学能与积累生物量的能力。
- 群体感应（QS）相关livG（支链氨基酸转运系统ATP结合蛋白）在最优组高4.2倍，影响氨基酸转运；Sec途径中SecA ATPase负责蛋白跨内膜分泌，过量组降低28.9%，蛋白分泌与转运受抑。
- ABC转运蛋白中cbiM、cbiQ调控钴/镍转运系统通透酶合成，过量组分别下调44.4%与40.7%，削弱对SCP生产必需的Ni与Co的转运；ProU转运蛋白（proX、proV、proW）负责甘氨酸甜菜碱输入以调节渗透压，在最优组上调，帮助维持胞内稳态。
- 过量碳源带来高浓度VFAs、氨氮与渗透压，可能对微生物产生毒性与渗透胁迫，这与其抑制生长、活性与SCP产量的结果一致。
工程与产业含义
- 餐厨垃圾发酵液可替代合成碳源用于PSB生产SCP，为有机固废资源化与低成本微生物蛋白生产提供路径，突破了碳源成本这一实际生产瓶颈。
- 碳源水平存在明确最优点（本研究中20% v/v发酵液），并非投加越多越好：40%时SCP产量下降约25%（2088.4→1566.7 mg/L）、生物转化率由0.99降至0.69 mg biomass/mg COD，运行中需据产量与转化率确定最优稀释比。
- 可利用的碳源调控指标包括VFAs/COD消耗比与相对细胞活性，二者在最优组分别达87.2%与对照的396.1%，可作为过程监控与投加优化的快速指标。
- 该策略面向餐厨垃圾“固废—酸液—蛋白”链条，可同时实现废物处置与高值产物生产，契合碳中和社会与可持续城市发展需求。
- 放大应用需考虑发酵液成分波动（本研究以富碳水化合物餐厨垃圾为单一来源）、pH调节（预处理调至pH 8）与灭菌过滤成本，以及避免高负荷导致的抑制。
适用与不适用场景
✅ 适用场景
- 以餐厨垃圾等有机固废厌氧发酵液为碳源、需兼顾废物处置与蛋白资源化的场景
- 以乙酸/混合VFAs为主要碳源、希望提高碳源转化效率（生物量产/COD消耗）的PSB批次培养
- 需要以转录与代谢通路证据理解碳源水平对SCP合成调控的机理研究
⚠️ 不适用 / 需谨慎
- 以单一合成碳源（如纯乙酸）为目标的最优条件直接套用（本研究为混合VFAs发酵液体系）
- 高有机负荷（如40% v/v发酵液）条件下期望提高产量与转化率的运行（该条件下出现抑制）
- 成分与本研究餐厨垃圾差异较大的发酵液（如高盐、高毒物或不同VFAs谱）未经重新优化
局限与不确定性
作者未解决 / 需要读者注意的问题
- 研究为摇瓶批次实验（100 mL工作体积、72 h），在30℃、160 rpm、白炽灯下进行，未验证放大与连续运行条件下的表现。
- 机制解释主要基于转录水平（TPM与GO/KEGG），未测定酶活或代谢物通量，通路受抑的结论缺少直接功能验证。
- 碳源水平的最优点（20% v/v）来自单一餐厨垃圾发酵液与单一菌株（R. capsulatus CGMCC 1.3366），向其他底物或菌株迁移需重新优化。
- 图1生长曲线中40%组后期OD600仍持续上升与正文“生长受抑”的表述存在图形与文字表述的张力，正文以72 h OD600读数界定抑制，解释依赖高VFAs、氨氮与渗透压的假设。
- 过量碳源的抑制被归因于VFAs与氨氮毒性及渗透压升高（引用文献支持），未在本实验中单独解耦验证各因素的贡献。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性声明为“The data that has been used is confidential.”；补充材料见期刊页面（含最优接种比实验等）。经费来自国家重点研发计划（2019YFC1906302）、上海市自然科学基金（22ZR1466900）与中国博士后科学基金（2021 M692423）。作者声明无已知竞争性经济利益或个人关系。