文献信息
英文题名
Pilot-scale production of microbial protein and PHA using purple phototrophic bacteria for single-cell bioplastics
作者
Luis D. Allegue, Sergio J. Gonzalez Camara, Maarten Muys, Shreyash Anil Gujar, Steven De Meester, Leen Bastiaens, Queenie Simons, Heleen De Wever, Joost Brancart, Siegfried E. Vlaeminck
期刊 / 年份
Bioresource Technology Reports 2026
DOI
10.1016/j.biteb.2026.102968
卷期 / 页码
35, 102968
单位
安特卫普大学生物基可持续工程（SUSTAIN）；Proviron；根特大学循环过程工程实验室；VITO；布鲁塞尔自由大学物理化学与聚合物科学
一句话概括：在 axenic 中试规模用合成 PPB 共培养（Rp. palustris + Cb. sphaeroides）把乙醇转化为同时富含蛋白与 PHB 的生物量，通过温和水相分级与甘油增塑制得蛋白膜与单细胞膜，论证了无需溶剂纯化即可获得成膜材料。
一图不看也要知道的几件事
- 筛选阶段比较 Cb. sphaeroides、Rp. palustris、Rb. capsulatus、Rsp. rubrum 与共培养在乙醇/甲醇上的 μmax，共培养在乙醇上最高（≈2.5 d−1，p<0.05）。
- 中试 PBR 工作体积 220 L，N2/CO2 鼓泡（总流量 3–7 L/h，CO2 气相维持 1% v/v），30 ± 2 ℃，蓝红光 LED 连续光照 486 μmol/(m2·s)。
- 运行 95 天，乙醇 OLR 3 gCOD/(L·d)（相当于 1.44 g 乙醇/(L·d)），C/N=5（NH4Cl 为氮源），SRT 2 天。
- 工作日每天收获 50% 反应器体积（其中 100 mL 用于分析），周末仅收获/补料 10%，形成 5 天碳充足 + 2 天碳受限的循环。
- 蛋白含量稳定在 42%–58% VSS；PHA 由第 1 周约 10% VSS 升到第 10 周后约 40% VSS 平台，单周峰值 PHB 42 ± 8% VSS。
- 仅检出 PHB，PHV 或其他共聚物 <1% PHA。
- 最大生物量产率 2.15 ± 0.12 g VSS/(L·d)，PHB 产率 0.91 ± 0.22 g PHB/(L·d)；估算反应器 PHB 浓度 1.8 ± 0.3 g PHB/L。
- 表观生物量产率 1.49 g VSS/g 乙醇，对应 1.29 gC生物量/gC乙醇，说明生物量形成需无机碳同化参与。
- Rp. palustris 全程保持 >75% 相对丰度优势，Cb. sphaeroides 作为少数伙伴持续存在。
- 珠磨破碎度平均 48 ± 6%（以有机质计）；分级后 81 ± 5% 总 PHB 进入沉淀、57 ± 10% 蛋白进入粗提液；等电沉淀把蛋白纯度仅由 66% 提到 70% 干重，但损失约三成干物质，蛋白浓缩物仅保留初始蛋白的 41 ± 5%。
- 离心收获效率 95 ± 5%，终总固含 20 ± 3%；可溶性碳去除平均 70 ± 12%，最高 84%。
研究背景与要解决的问题
塑料污染问题严重，每年约 4 亿吨塑料废弃物产生；近半生物基塑料（含生物聚乙烯）不可降解，可降解材料在真实处理系统中也常表现不佳，因此转向纤维素、淀粉、蛋白与 PHA 类材料。
PHA 是可生物降解的微生物聚酯，但生产成本是主要瓶颈；植物/动物蛋白基生物塑料则与耕地和淡水竞争，可能加剧蛋白供应链压力。
微生物基生物塑料膜此前仅在实验室规模以异养微生物蛋白（如马铃薯加工水培养）实现；后来有蛋白富集单细胞生物量的高氧气阻隔膜与托盘报道，PHB 与蛋白混合可改善热机械性能。
PPB 因高碳转化效率与光异养条件下有效利用光能而具吸引力，但蛋白与 PHA 的联产用于生物塑料此前未被证明；乙醇/甲醇作为唯一碳源也未被系统评价，而这类底物可由 CCU（如 power-to-ethanol、CO2 到乙醇）提供。
本研究展示以乙醇为底物的 PPB 共培养中试规模培养，实现胞内 MP 与 PHB 共同积累，并把分级产物直接塑化成膜。
概念与技术边界
PPB（紫光养细菌）
能在光异养条件下利用有机物并高效利用光能的紫色细菌，兼具产微生物蛋白与合成 PHA 的能力。
PHB（聚羟基丁酸酯）
PHA 的一种，微生物胞内聚酯，可生物降解；由乙酰-CoA 合成，因此偶数碳 PHA 更易生成。
μmax（最大比生长速率）
指数生长期 ln(OD660) 对时间作图的线性区斜率，本文用作菌种/共培养筛选的主要判据。
SRT（固体停留时间）
生物量在系统中的平均停留时间；本文通过每天收获 50% 体积实现 2 天 SRT。
OLR（有机负荷率）
单位反应器体积每日进料有机负荷，本文为 3 gCOD/(L·d)。
珠磨（beadmilling）破碎
用珠磨机循环处理冷冻生物量以破坏细胞壁、释放胞内蛋白，本文以破碎度评估效果。
等电沉淀（ISP）
把提取液 pH 调到等电点（本文 pH 4.5）使蛋白沉淀；会同时共沉淀非蛋白固体，纯度提升有限。
甘油增塑
甘油亲水、羟基多，可形成超分子氢键，是亲水生物聚合物常用增塑剂，用于获得连续均匀膜。
FTIR / DSC / TGA
分别用于表征化学官能团、热转变（玻璃化、结晶、熔融）与热失重降解行为。
体系与方法
| 环节 | 做法与参数 |
|---|---|
| 菌种筛选 | 预选 Rp. palustris LMG 18881、Cb. sphaeroides LMG 2827、Rsp. rubrum S1H、Rb. capsulatus，以及 Rp. palustris + Cb. sphaeroides 共培养；500 mL 锥形瓶装 400 mL，28 ℃、36 W 可见光谱荧光灯 30 W/m2，氮气顶空置换 1 min；乙醇与甲醇各 2 gCOD/L（0.96 g/L 乙醇或 1.33 g/L 甲醇），初始 OD660=0.1，搅拌 300 rpm，每组三平行，用单因素方差分析 + Tukey 事后检验（α=0.05）。 |
| PBR 运行 | Axabio 食品级专利中试 PBR，220 L 工作体积，厌氧（N2/CO2 鼓泡）。连续运行 95 天，接种共培养生物量，乙醇进料 OLR 3 gCOD/(L·d)，C/N=5，NH4Cl 为氮源；每周一至五 SRT 2 天、每日收获 50% 体积，周末自动只收获/进料 10%；收获生物量连续离心（10,000 rpm）后冷冻保存；定期镜检与 16S rRNA 基因测序确认无菌运行。 |
| 分级策略 | 冷冻生物量解冻后经连续控温珠磨（DYNO-MILL Multi-lab，循环 1.2 L/min，最长 73 min/L，研磨腔有效停留最长 23 min）；悬液调 pH 8 后混匀、离心（10 min，16,500×g），沉淀为 PHB 富集相、上清为蛋白富集相；部分粗提液在 pH 4.5 沉淀 3 h 再离心浓缩蛋白；各相冷冻干燥。用干物质（105 ℃）、有机质、PHA 含量与蛋白（氮基，换算系数 6.25）表征，SDS–PAGE 分析蛋白分子量分布。 |
| PHB 纯化与表征 | PHB 富集固体以 2%(w/w) 固液比在 120 ℃、300 rpm 与环己酮回流 60 min；真空过滤去非 PHB 细胞物质；滤液加正己烷（3:1 于环己酮）作反溶剂沉淀 PHB，真空过滤后 80 ℃ 过夜干燥；FTIR（Bruker Tensor 27，4000–400 cm−1，4 cm−1，10 次扫描）、TGA-FTIR（NETZSCH TG 209 F3 + Nicolet iS20，30→400 ℃，10 K/min，N2 60 mL/min）、DSC（NETZSCH DSC 204F1，20→210 ℃→30 ℃→210 ℃，10 K/min）。 |
| 成膜与单细胞塑化 | 两种原料：(i) 蛋白富集提取物约 67% 蛋白（干重）、<1% PHB；(ii) 未分级的破碎单细胞生物量，约 36% PHB、45% 蛋白与残余细胞碎片。各取 1.00 g 冻干料分散于 50 mL 去离子水，搅拌 60 min 后按干固体 0、10、20、33 wt% 加甘油再混 15 min，倒入 PTFE 模具、脱气、真空干燥至恒重，23 ℃/50% RH 调节 48 h；另用同一单细胞材料做热塑挤出中试验证连续片材。膜用 DSC（二次升温）与 TGA（10 K/min，氮气）表征，单细胞膜测单轴拉伸性能。 |
| 分析与统计 | 每日取样测 OD660/805、pH、温度、PHB、tCOD、蛋白，过滤样测乙醇、sCOD、NH4+；COD 与 NH4+ 用 NANOCOLOR 试剂盒；蛋白用 Lowry 法（牛血清白蛋白标曲，报为真蛋白 %VSS）；PHA 经 GC-FID 定量（PHB/PHV 标准品标曲）；乙醇用 Rezex ROA-Organic Acid H+ 柱 HPLC-RID。16S rRNA V3–V4（341F/806R），Illumina PE250，nf-core/ampliseq 2.7.0 + DADA2 + GTDB R08-RS214.1。所有数据与误差棒为 95% 置信区间。 |
主要结果（原文图表逐条解读）
图示信息：分组柱状图：横轴为五个菌株/共培养，分乙醇与甲醇两组，纵轴为 μmax（d−1），柱体带误差棒与显著性字母。
论文结果：乙醇上共培养最快（约 2.4–2.5 d−1，显著高于其他条件），Rb. capsulatus（约 1.6）、Rp. palustris（约 1.4）次之，Cb. sphaeroides 与 Rsp. rubrum 最低（约 0.4）；甲醇上所有菌株生长都低且相近（约 0.3–0.55 d−1，无显著离群）。乙醇上各培养物消耗 75%–95% 的乙醇，生物量产率约 1 gCOD生物量/gCOD消耗。
研究意义：乙醇比甲醇更适合作为这些菌株（尤其共培养）的碳源，共培养被选作放大实验的菌种。文中指出仅以 μmax 作筛选依据是局限，因其不能反映产物形成潜力。
图示信息：上下两个箱线图，横轴为第 1–13 周，纵轴为蛋白（% VSS）与 PHA/PHB（% VSS）。
论文结果：蛋白含量在 13 周内保持相对稳定，范围 42%–58% VSS，后期略有下降（归因于 PHA 含量升高）；PHA（PHB）由第 1 周约 10% VSS 持续上升，至第 10 周后进入约 40% VSS 平台，单周峰值 42 ± 8% VSS。残余 NH4+ 从未低于 50 mg N/L。
研究意义：在碳充足/碳受限交替的收获策略下，蛋白合成基本稳定而 PHB 逐步富集，说明可实现蛋白与 PHB 的同体共同积累；PHB 高于此前 PPB 连续反应器水平，但仍低于优化异养菌（约 70% VSS）。作者指出表型富集的机制（遗传异质适应或生理选择）未作研究。
图示信息：三面板：(a) FTIR 吸光度对 4000–500 cm−1，两样品均显示酯羰基峰与指纹区多个谱带；(b) DSC 热流对 20–220 ℃，均出现熔融转变；(c) TGA 质量损失对 0–400 ℃，紫线逐步降解留约 15% 残渣，蓝线在约 280–300 ℃ 急剧分解至约 0% 残渣。
论文结果：FTIR 显示 PHB 特征吸收带约 1276 cm−1（–CH）、1720 cm−1（C=O 伸缩）、2975–2932 cm−1（–CH3 与 –CH2），另有约 3432 cm−1 的弱 OH 带，与文献 PHB 一致；约 1099 cm−1 的弱带指示 DNA、RNA 或多聚磷酸等微量杂质。熔融温度约 171 ℃；PPB-PHB 熔融焓高于商业参照，提示结晶度更高；TGA 显示 PPB-PHB 起始降解温度（5% 失重）约 247 ℃，低于参照约 276 ℃，且呈多步失重。
研究意义：PPB-PHB 在官能团与熔融行为上与商业 PHB 一致，但分子质量（更低平均分子量、更宽分布、更多链端或痕量低聚物）导致热稳定性略差；这反映分子质量差异而非热功能增强，定量纯度与结构仍需 1H NMR 等补充确认。
图示信息：六面板：(a) 蛋白富集（蓝）与整细胞（橙）分级物的 DSC；(b) 两者 TGA，呈多步降解并在约 280 ℃ 附近交叉；(c) 0、10、20、33 wt% 增塑剂膜的 DSC；(d) 对应 TGA，高增塑剂含量（尤其 33 wt%）使降解向低温移动；(e) 白底上大小递减的深色不规则膜片；(f) 戴手套手持红棕色方形膜样品。
论文结果：蛋白富集物除约 60 ℃ 蛋白变性吸热峰与 120 ℃ 以上化学反应的放热峰外无显著热物性；整细胞在约 100 ℃ 有宽吸热峰（残余水蒸发），149 ℃ 起有尖锐熔融峰，但 19.2 wt% PHB 不足以形成跨材料物理网络，材料无法热再加工成一致膜。甘油使单细胞相形成连续均匀膜；拉伸应变由 1.63% 增至 3.66%、10.5%，杨氏模量由 439 ± 78 MPa 降至 116 ± 43 MPa、51.6 ± 17.0 MPa，断裂拉伸强度由 4.14 ± 0.49 MPa 降至 1.47 ± 0.38 MPa；Tg 由约 3 ℃ 降至 −4 ℃（20 wt% 甘油）；熔融焓由 67.3 J/g（0 wt%）降至 11.3 J/g（10 wt%）、2.4 J/g（33 wt%），起始熔融温度由 149 ℃ 升至 156–169 ℃。挤出中试可连续出片。
研究意义：甘油能有效增塑亲水基体、实现内聚成膜并提高延展性，但膜内未形成连续 PHB 富集网络，力学强度受限（LDPE 通常拉伸强度 >10 MPa、断裂伸长 >200%，本膜仅 1.47–4.14 MPa 与 1.63%–10.5%）。结果定位为概念验证：无需溶剂纯化即可把最简加工 PPB 生物量转为内聚生物塑料膜。
图示信息：按甘油含量 0、10、20、33 wt% 列出杨氏模量 E（MPa）、断裂拉伸强度 σ（MPa）、断裂伸长率 ε（%）、Tg（℃）、Tm（℃）与熔融焓 ΔH（J/g），数值为均值 ± CI95。
论文结果：0 wt%：E、σ、ε 均未测定（n.d.），Tg 3 ℃、Tm 149 ℃、ΔH 67.3 J/g；10 wt%：E 439 ± 78 MPa、σ 4.14 ± 0.49 MPa、ε 1.63 ± 0.36%、Tg 未测、Tm 156 ℃、ΔH 11.3 J/g；20 wt%：E 116 ± 43 MPa、σ 2.32 ± 1.10 MPa、ε 3.66 ± 1.25%、Tg −4 ℃、Tm 158 ℃、ΔH 11.2 J/g；33 wt%：E 51.6 ± 17.0 MPa、σ 1.47 ± 0.38 MPa、ε 10.5 ± 3.30%、Tg 未测、Tm 169 ℃、ΔH 2.4 J/g。Tm 取复杂熔融轨迹的起始温度。
研究意义：清晰体现延展性与刚度的权衡：随甘油增加，材料变软变韧、结晶度下降、熔融温度升高（增塑促进更少但更完善的晶片形成）。
机制小结
- 乙醇代谢主要生成乙酰-CoA，因此倾向于合成偶数碳 PHA（PHB），检出的 PHV 或其他共聚物 <1% PHA。
- 碳充足（5 天）/碳受限（2 天）交替的收获策略，逐步富集高 PHB 积累能力的表型。
- 表观生物量产率 1.49 g VSS/g 乙醇（1.29 gC生物量/gC乙醇）高于乙醇碳可支持的量，说明生物量形成还需无机碳（CO2 固定）同化参与，符合光养/混养系统 1.2–1.7 g/g 底物的常见范围。
- 培养液不积乙酸（尽管乙醇被氧化），说明生成的乙酸被快速同化；Rp. palustris 优势可能与其高效同化乙醇来源的乙酰-CoA 有关，Cb. sphaeroides 或占据利用乙酸等瞬时中间体的互补生态位。
- 珠磨破碎后 81% 总 PHB 进沉淀、57% 蛋白进上清，构成后续分级与直接塑化的物料基础；pH 8 下膜结合与疏水蛋白溶解不完全，限制了等电沉淀的纯度提升。
工程与产业含义
- 以乙醇为碳源的 PPB 工艺可与 CCU 路线（power-to-ethanol、生物催化 CO2 到乙醇）对接，为近零排放微生物蛋白生产提供下游用户路径。
- 温和水相分级（珠磨 + pH 驱动分离）避免有机溶剂与强变性条件，保留了材料功能性并兼容后续塑化；两股产物（蛋白富集相与 PHB 富集单细胞相）可分别利用或复合。
- 不做 PHB 纯化、直接使用破碎整细胞时，细胞中所有碳都留在最终材料中，在忽略离心/干燥/破碎损失的前提下碳保持率很高，既简化流程又可能降低成本与环境影响。
- 碳平衡估算：以 1 kg 乙醇为起点，过程约产出 0.47 kg 纯化 PHB 与 0.36 kg 微生物蛋白提取物，其余碳进入损失与侧流。
- 本装置光照为微藻调校，光强与光谱未针对 PPB 优化，高生物量浓度下体积光强通常成为限制，因此放大评估对可达产率而言偏保守。
- 深色（类胡萝卜素、细菌叶绿素、血红素蛋白）限制透明/美观用途，近期更现实的场景是非食品包装与低风险用途（可堆肥膜、农用地膜、二次包装）。
适用与不适用场景
✅ 适用场景
- 以乙醇等 C2 中间体（含 CO2 源乙醇）为底物的 PPB 中试/工业规模 MP 与 PHB 联产工艺设计
- 希望简化下游、避免溶剂纯化的单细胞生物塑料薄膜概念验证与配方开发
- 蛋白富集相作为饲料或食品原料、或与 PHB 富集生物量复配成膜的产物路线规划
- 以二氧化碳固定贡献生物量产率的混养/光养系统碳平衡评估
⚠️ 不适用 / 需谨慎
- 要求高透明度、浅色或食品接触场景，需额外纯化、漂白或复配并完成法规与迁移测试
- 要求与 LDPE 相当的力学性能（本膜拉伸强度与断裂伸长率显著偏低）
- 直接外推到规模化连续挤出，本文挤出仅为单独中试验证
局限与不确定性
作者未解决 / 需要读者注意的问题
- 选用 μmax 作为唯一放大筛选判据，不能反映产物形成潜力；批次实验对 PHA 积累与产率的估计不可靠。
- 未直接测定 CO2 固定，碳平衡只能视为指示性。
- 无菌运行不等于食品级生产；面向食品接触需专门的安全与合规计划（EU 1935/2004、94/62/EC 等）。
- 仅检出并报道 PHB，未做定量纯度与结构确认（如 1H NMR）。
- PHB 富集相经环己酮提取后带有深色色素污染，商业化需额外纯化步骤。
- 膜的力学性能偏低、单细胞膜内未形成连续 PHB 网络；成膜与挤出的工艺优化超出本研究范围。
- 表型富集机制（遗传异质适应 vs 生理选择）未研究。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性：数据可应诉求提供（Data will be made available on request）。经费：弗兰德斯研究基金会（FWO）PROMIPOL 项目 [GOG3922N]；L.D.A. 获 FWO-Vlaanderen 青年博士后奖学金 [12A2925N]。利益冲突：作者声明无已知的竞争性财务利益或个人关系。