文献信息
英文题名Purple bacteria as added-value protein ingredient in shrimp feed: Penaeus vannamei growth performance, and tolerance against Vibrio and ammonia stress
作者Abbas Alloul, Mathieu Wille, Piergiorgio Lucenti, Peter Bossier, Gilbert Van Stappen, Siegfried E. Vlaeminck*
期刊 / 年份Aquaculture · 2021 · 530, 735788
DOI10.1016/j.aquaculture.2020.735788
文献类型研究论文
获取方式订阅期刊（Elsevier）
5%–25%
终末个体重相对商业饲料的提升（Rb. capsulatus 组）
p < 0.05
1.3–1.4 vs 1.7
饲料系数 FCR（g 饲料/g 虾生物量）
PNSB 组 vs 对照组，p < 0.05
63%–75% vs 8%
48 h 氨氮胁迫存活率（Rps. palustris 组 vs 对照）
NH₃-N 3 mg N/L（48 h-LC50）
88 ± 2%
对副溶血弧菌 TW01 的最大生长速率抑制
光异养培养的 Rps. palustris，冻干菌体
67.0 / 66.9 / 73.7 g/100 g DW
三种 PNSB 菌粉的粗蛋白含量
Rps. palustris 纯培养 / Rb. capsulatus 纯培养 / Rb. capsulatus 富集培养
33 倍
28 天体重增长倍数
既有 PNSB 对虾研究为 8–12 倍
87 ± 4%
28 天总体存活率
各处理与对照无显著差异（p > 0.05）
一图不看也要知道的几件事
- 在 28 天南美白对虾（Penaeus vannamei）后期幼体投喂试验中，用 PNSB 菌粉替代豆粕与/或鱼粉蛋白至 5 与 11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白 水平，生长表现与商业饲料相当甚至更好：荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）组个体重高出 5%–25%（p < 0.05），饲料系数 1.3–1.4 显著优于对照的 1.7 g 饲料/g 虾生物量（p < 0.05）。
- 沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）在 5% 替代水平下个体重比商业饲料高 26%、FCR 为 1.3（p < 0.05）；在 11% 水平下比生长率 13.5 ± 0.4% d⁻¹ 显著高于对照的 12.6 ± 0.5% d⁻¹（p = 0.02）。28 天总体存活率 87 ± 4%，各组无显著差异。
- 最突出的附加价值出现在氨氮耐受性上：在 3 mg N/L（对照虾的 48 h-LC50）氨氮胁迫下，投喂 Rps. palustris 的虾 48 h 存活率为 63%–75%，而商业饲料组仅 8%（p < 0.05）；Rb. capsulatus 组则与对照无差异。
- 体外试验证实 PNSB 有抗弧菌能力：冻干菌体中光异养培养的 Rps. palustris 对副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）TW01 的生长速率抑制达 88 ± 2%，光自养培养的 Rps. palustris 对坎氏弧菌（V. campbellii）达 80 ± 2%；琼脂点样试验中只有 Rb. capsulatus 与 Rps. palustris 形成抑菌圈。代谢型（光异养/化能异养/光自养）不影响抑菌效果的一致性（p > 0.05）。
- 但体外抑菌没有转化为体内保护：投喂 PNSB 的虾在弧菌攻毒试验中死亡率与对照无显著差异。原文由此推断 PNSB 可能只在与病原直接接触时才能抑制弧菌，并建议把干燥 PNSB 做成独立颗粒与饲料分开投喂，以同时获得蛋白价值与直接抑菌作用。
证据边界
证据来自受控实验室水产试验：南美白对虾以 PL10 后期幼体自美国 Shrimp Improvement Systems 引进（已认证对 WSSV、YHV/GAV/LOV、TSV、IHHNV、BP、MBV、BMN、IMN、微孢子虫、单孢子虫与 NHP 细菌无特定病原），实验室驯化一周，试验起始个体重 9.3 ± 0.5 mg。投喂试验用 24 个 30 L 方形灰色 PVC 缸（表面积 0.135 m²）、每缸 100 尾、28–29 ℃、12 h 光/12 h 暗、天然海水盐度 35 g/L、pH 7.8–8.1，4 套独立循环系统按随机区组排列、循环量为缸体积的 700%/d，每日 9/13/17 时投喂三次。每个处理 4 个重复，但因数据缺失实际统计的 n 不等（对照与 Rps. palustris 两水平 n=4，Rb. capsulatus 5% n=3、11% n=2，富集培养 n=4），其中 Rb. capsulatus 11% 组仅 n=2，其显著性结论应谨慎解读。攻毒试验每虾单独装入 1 L 塑料盒（500 mL 海水）以排除自相残食，氨氮胁迫 2 个重复（每重复 8 盒，共 16 尾）、弧菌攻毒 3 个重复（共 24 尾）。体外试验为 96 孔板（150 µL 工作体积，n=3）与琼脂点样（n=3），弧菌初始接种 10⁵ cells/mL。所用 PNSB 为挥发性脂肪酸合成培养基（乙酸/丙酸/丁酸 1/1/1，COD 3 g/L）培养后冻干的菌粉，其中“富集培养”作为废水生产 PNSB 的替代物（proxy），并非真的用废水生产。饲料蛋白替代水平仅 5–11%，未测试更高替代率。
研究背景与要解决的问题
水产养殖是增长最快的食品生产部门，预计到 2030 年将提供人类消费鱼类的 60%。数十年来贸易量最大的水产品是虾，占总产量的 15%。而对虾养殖乃至整个水产养殖都依赖鱼粉、豆粕这类饲料蛋白源，它们的环境影响很高。因此寻找新型蛋白源是降低对传统蛋白依赖、保障水产业可持续增长的前提。
用微生物菌体作为饲料蛋白源——即微生物蛋白或单细胞蛋白（single-cell protein, SCP）——提供了一条可持续替代路线，若用可再生或回收资源生产则更进一步。但这里有一个绕不开的经济现实：即使用废水生产，微生物蛋白的生产成本仍将高于鱼粉（2 €/kg 蛋白）或豆粕（0.7 €/kg 蛋白）的市场价。 因此必须去发掘微生物蛋白在营养成分之外的附加价值属性，比如促进对虾生长与健康，才能提高产品价值。这是本文选题的经济逻辑起点。
紫色非硫细菌（purple non-sulfur bacteria, PNSB）是很有前景的微生物蛋白来源：其菌体富含必需维生素与类胡萝卜素色素，营养价值高；由于能在光照厌氧条件下生长，可在废水上高选择性地生产蛋白。它们在水产养殖中作为益生菌的使用被认为很重要，尤其在中国。但作为大宗蛋白原料，据作者所知尚无全规模应用，只有若干鱼类研究显示前景。其中最相关的是 Delamare-Deboutteville 等的研究：在 21 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白的替代水平下，亚洲鲈鱼（Lates calcarifer）的生长表现与商业饲料相当。
而 PNSB 用于对虾饲料的研究非常有限。此前唯一相关研究（Chumpol 等，2018）的蛋白替代水平只有 1.2–5.8 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白，主要观察免疫指标，且饲料是把 PNSB 加入磨碎的商业饲料而非替代其中的蛋白，因此原文认为那更像一项益生菌研究而不是蛋白替代研究。此外，PNSB 活体投入虾池已被证明有抗弧菌作用，体外琼脂平板试验也显示 Rhodobacter sphaeroides 与 Afifella marina 的某些菌株有抗弧菌性质，但迄今没有研究考察“含在饲料中的 PNSB”是否具备抗弧菌潜力。
为什么弧菌与氨氮是两个必须测的胁迫
本文选用的两株弧菌是急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND）的病原，这是对虾业最具破坏性的疾病之一——它在 20–30 天内侵袭对虾后期幼体，可造成高达 100% 的死亡率与巨大经济损失。氨氮则是养殖水体最常见的理化胁迫：高浓度氨氮会诱发氧化应激并导致对虾肝胰腺细胞凋亡。这两项挑战正好对应“抗病”与“抗逆”两类附加价值。
因此本文设定四条并行的工作：① 28 天后期幼体投喂试验，用 Rps. palustris 与 Rb. capsulatus 两个纯培养各两个替代水平，加上一个含 Rb. capsulatus 的富集培养作为“废水生产 PNSB”的替代物；② 氨氮胁迫试验，验证饲料中加入 PNSB 是否改善体质/抗逆；③ 弧菌攻毒试验，验证抗病力；④ 平行的体外筛选，考察代谢型（光异养、化能异养、光自养）以及活菌或冻干菌体投加方式对两株弧菌生长的影响。
体系与方法
纯培养生产Rps. palustris LMG 18881 与 Alloul 等分离的 Rb. capsulatus，在 500 mL 摇瓶中光异养培养；培养基为乙酸/丙酸/丁酸 1/1/1 的挥发性脂肪酸混合物，COD 浓度 3 g/L；两只卤素灯照明、光强 36 W/m²；多点磁力搅拌 300 rpm；28 ℃；培养 72 h 后收集至 20 L 罐（留 50 mL 作下批接种）
富集培养生产100 L 跑道池反应器（MicroBio Engineering），表面体积比 5 m³/m²，污泥龄 2 d，同一 VFA 培养基，温度 28 ℃、pH 控制在 7，卤素灯光强 54 W/m²、12 h 光/12 h 暗，桨轮 30 rpm 搅拌。群落含 14%–56% PNSB，其中 Rb. capsulatus 为最优势种（占总生物量 14%–54%），另有 Rhodopseudomonas 成员最高 2%；侧翼属为 Arcobacter、Dysgonomonas 与 Acinetobacter；未检出紫硫细菌、绿色（非）硫细菌或蓝细菌
菌体后处理7300 g 离心 5 min，蒸馏水洗两次去盐后再离心，冻干 48 h，研钵磨粉，−20 ℃ 保存备用于配料
六种饲料(i) 不含 PNSB 的商业配方（对照）；(ii)(iii) Rps. palustris 纯培养 5 与 11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白；(iv)(v) Rb. capsulatus 纯培养 5 与 11；(vi) 含 Rb. capsulatus 的富集培养 11。替代对象是豆粕与/或鱼粉，其余营养水平保持一致（脂肪比例、多不饱和脂肪酸含量、钙磷比），全部配方按蛋白 35%、脂肪 7% 等值设计
制粒配方由 VDS（比利时）用 Mevoblend 软件完成；原料均为工业级（黏合剂羧甲基纤维素除外）；厨用搅拌机混合加水成硬面团 → 4 mm 孔径绞肉机挤条 → 室温干燥 48 h → 粉碎筛分为 300–500、500–800、800–1000、1000–1200 µm 四个粒径 → 包装 4 ℃ 保存
投喂试验24 个 30 L PVC 缸、每缸 100 尾、随机区组、4 套独立循环单元（每单元 6 缸 + 浸没式生物滤池 + 集水池），循环率 700%/d，约 10% 新鲜海水补充蒸发与虹吸损失；每日 9/13/17 时投喂三次，投喂量按 FCR 1.6 与 SGR 15%/d 计算，每周抽约 20 尾称重校正投喂量；每日虹吸残饵与粪便；日测盐度（手持折射仪）、温度、NH₄⁺-N 与 NO₂⁻-N（Tetra 试剂盒）
生长指标计算增重 = 终重 − 初重；SGR = 100 × (ln 终重 − ln 初重)/试验天数；FCR = 摄食量/增重；存活率 = 终末尾数/初始尾数 × 100
96 孔板抑菌试验150 µL 海水肉汤工作体积，弧菌接种 10⁵ cells/mL（OD550 = 1.0 对应 1.2 × 10⁹ cells/mL），PNSB/微藻/好氧菌群按挥发性悬浮固体 0.5 g/L 投加；冻干菌体先加 2 mL 无水乙醇杀灭并在层流罩下挥干；28 ℃、282 rpm 剧烈振荡通气，连续测 660 nm 吸光度；四类对照——弧菌单独（用于算抑制率）、PNSB 单独（检验冻干+乙醇处理后菌体是否仍可复活）、仅培养基（污染检验）、20 mg/L 利福平（阴性对照）；抑制率 =（弧菌生长速率 − 弧菌+PNSB 生长速率）/弧菌生长速率 × 100
琼脂点样试验三类培养基（光异养/光自养/化能异养）加 15 g/L 琼脂做方形平板；五种 PNSB 先统一光异养预培养以保证初始接种一致，取 2 µL 三重点样；按各自代谢型 28 ℃ 培养（光异养=氮气厌氧袋+卤素灯，光自养=氢气厌氧袋+卤素灯，化能异养=黑暗）48 h 后，覆盖含 10⁵ cells/mL 弧菌的 5 g/L 软琼脂，再培养 48 h，从菌落边缘量到抑制区边缘；0.22 µm 过滤上清作阴性对照
代谢型设置光异养：光照厌氧、VFA 为碳源；光自养：把碳源换成顶空氢气（电子供体）、光照 28 ℃；化能异养：把 VFA 换成果糖（COD 3 g/L）、黑暗好氧 28 ℃
氨氮胁迫先用对照饲料虾做剂量摸索（NH₃-N 0、0.5、1、1.7、3、5.3 mg N/L，pH 8 下加 NH₄Cl），记录 24 与 48 h 存活率，以可变 Hill 斜率的 S 形剂量-效应模型拟合得 48 h-LC50 = 3 mg N/L（95% 置信区间 1.7–4.0 mg N/L），即以该浓度评价各组体质
弧菌攻毒副溶血弧菌 V. parahaemolyticus TW01（取自泰国 AHPND 病虾、经柯赫法则确认）投加 10⁶ cells/mL；坎氏弧菌 V. campbellii LMG 21363 投加 10⁷ cells/mL，并同时施加 35 mg N/L 氨氮（对照虾的 24 h-LC10）以提高易感性；每 12–14 h 观察存活，最长 5 天；因 62 h 时 V. campbellii 组几乎未受影响，追加了一剂 10⁷ cells/mL；死亡率（%/h）按死亡与时间的斜率计算
成分分析干重与含水率 105 ℃ 24 h 重量法（3–4 重复），550 ℃ 灰化 2 h 测灰分；总脂按 Bligh & Dyer 重量法；蛋白用 Markwell 法（改良 Lowry，3 重复）与凯氏定氮（4 重复）
统计方差分析 + Tukey 事后两两比较；Shapiro-Wilk 检验正态性、Levene 检验方差齐性；正态性不满足改用 Kruskal-Wallis + Mann-Whitney U（Benjamini-Hochberg 校正）；方差不齐或样本量不等用 Welch t 检验；回归线比较用协方差分析；显著性水平 p < 0.05；R 3.4.1 + RStudio
表 1 三种 PNSB 菌粉的常规成分分析（复刻自原文 Table 1，均值 ± 标准差，n = 3）
| 指标 | Rps. palustris（纯培养） | Rb. capsulatus（纯培养） | Rb. capsulatus（富集培养） |
|---|---|---|---|
| 干重 (g/100 g 产品) | 79.4 ± 1.1 | 81.6 ± 0.4 | 89.7 ± 1.7 |
| Markwell 蛋白 (g/100 g DW) | 48.1 ± 3.5 | 48.0 ± 3.1 | 60.5 ± 0.2 |
| 粗蛋白 (g/100 g DW) | 67.0 ± 1.6 | 66.9 ± 5.9 | 73.7 ± 5.5 |
| 脂类 (g/100 g DW) | 14.7 ± 5.3 | 14.6 ± 7.6 | 13.1 ± 2.2 |
| 灰分 (g/100 g DW) | 35.8 ± 2.4 | 36.4 ± 3.3 | 17.1 ± 2.8 |
两个容易被忽略的成分细节
第一，Markwell 蛋白（约 48%）与粗蛋白（约 67%）之间差距很大，说明凯氏定氮法测得的“粗蛋白”包含核酸等非蛋白氮，用于配方计算时口径必须统一。第二，两个纯培养的灰分高达 35.8% 与 36.4%，而富集培养仅 17.1%——高灰分会稀释配方中的有效营养并影响钙磷平衡，这是纯培养菌粉在饲料应用中一个实际的负担；富集培养在这一点上反而更有优势。
表 2 六种饲料的配料组成与成分（复刻自原文 Table 2，单位 g/100 g 产品；成分为均值 ± 标准差）
| 项目 | 对照 | Rps. p. 5% | Rps. p. 11% | Rb. c. 5% | Rb. c. 11% | Rb. c. 富集 11% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| PNSB | 0 | 5 | 10 | 4.6 | 9.5 | 7.0 |
| 小麦粉 | 31.0 | 30.2 | 38.4 | 30.4 | 39.0 | 30.1 |
| 豆粕 | 38.0 | 38.0 | 17.2 | 38.0 | 17.1 | 37.4 |
| 鱼粉 | 20.0 | 17.4 | 27.7 | 17.3 | 27.6 | 15.0 |
| 蛋氨酸 | 0.0 | 0.05 | 0.0 | 0.05 | 0.0 | 0.0 |
| 金枪鱼油 | 2.5 | 2.2 | 0.8 | 2.2 | 0.9 | 2.2 |
| 甲壳类预混料 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| Ca(H₂PO₄)₂ | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| CaCO₃ | 1.5 | 1.5 | 0.2 | 1.5 | 0.2 | 1.5 |
| 羧甲基纤维素 CMC | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 卵磷脂 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| Markwell 蛋白 (g/100 g DW) | 36.22 ± 0.2 | 36.15 ± 3.95 | 35.72 ± 0.44 | 36.37 ± 2.02 | 38.03 ± 0.5 | 36.94 ± 1.12 |
| 粗蛋白 (g/100 g DW) | 37.86 ± 0.55 | 39.21 ± 0.28 | 39.75 ± 0.22 | 38.32 ± 0.37 | 46.76 ± 0.19 | 37.79 ± 0 |
| 脂类 (g/100 g DW) | 7.52 ± 0.47 | 7.79 ± 0.78 | 7.09 ± 1.28 | 7.34 ± 0.47 | 9.06 ± 0.31 | 7.48 ± 0.84 |
| 灰分 (g/100 g DW) | 12.87 ± 0.68 | 11.55 ± 0.65 | 11.13 ± 3.58 | 10.9 ± 0.27 | 13.54 ± 0.29 | 10.79 ± 0.79 |
配料表里有一处值得注意的结构性变化：在 11% 替代水平上，配方并不是简单减少一种原料——豆粕由 38.0 降到约 17.1–17.2，鱼粉反而由 20.0 升到约 27.6–27.7，小麦粉也由 31.0 升到约 38.4–39.0。原文明确说明配方目标是“替代水产饲料中总体上可持续性较差的蛋白原料，而不必然专门针对鱼粉”，并保持其它营养水平恒定。此外 Rb. capsulatus 11% 组的实测粗蛋白为 46.76 g/100 g DW，明显高于其余各组的 37.8–39.8，这一偏差在解读该组生长优势时需要考虑。
主要结果（投喂试验数据与原文 Fig. 1–3 解读）
结果分两条主线：营养价值（生长表现）与附加价值（抗逆、抗病）。附加价值这条线上，体外试验与体内攻毒得出了不一致的结论，这是本文最值得推敲的部分。
表 3 南美白对虾 28 天投喂试验结果（复刻自原文 Table 3；均值 ± 标准差；不同上标字母代表差异显著，p < 0.05；各组 n 不等，见成分说明）
| 指标 | 对照饲料 (n=4) | Rps. p. 5% (n=4) | Rps. p. 11% (n=4) | Rb. c. 5% (n=3) | Rb. c. 11% (n=2) | Rb. c. 富集 11% (n=4) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 初始个体重 (mg) | 9.5 ± 0.7 | 9.6 ± 1.3 | 8.5 ± 1.0 | 9.1 ± 0.8 | 10 ± 0.7 | 9.3 ± 0.7 |
| 终末个体重 (mg) | 320.4 ± 19.9 b | 404.5 ± 55.2 a | 376.6 ± 71.5 ab | 371.4 ± 17.6 a | 400.3 ± 1.7 a | 336.9 ± 42.1 ab |
| 增重 (mg) | 310.9 ± 20.6 b | 394.9 ± 55.2 a | 368.2 ± 70.6 ab | 362.1 ± 17 a | 390.3 ± 0.7 a | 327.5 ± 41.5 ab |
| SGR (% d⁻¹) | 12.6 ± 0.5 b | 13.4 ± 0.6 ab | 13.5 ± 0.4 a | 13.2 ± 0.3 ab | 13.2 ± 0.3 ab | 12.8 ± 0.2 b |
| FCR (g 饲料/g 虾生物量) | 1.7 ± 0.2 a | 1.3 ± 0.1 b | 1.5 ± 0.5 ab | 1.4 ± 0.1 bc | 1.3 ± 0.1 b | 1.7 ± 0.2 ac |
| 存活率 (%) | 83.8 ± 5.1 | 87.8 ± 5.7 | 85.5 ± 5.5 | 88.3 ± 4.9 | 92.0 ± 4.2 | 84.5 ± 7.0 |
总体比生长率平均为 13.2 ± 2.7% d⁻¹，与田间水平相当。显著改善集中在三种饲料上：Rps. palustris 5%、Rb. capsulatus 5% 与 11% 的终末个体重与 FCR 均显著优于对照；Rps. palustris 11% 组则在 SGR 上唯一取得显著优势（13.5 ± 0.4 vs 对照 12.6 ± 0.5% d⁻¹，p = 0.02）。富集培养组（Rb. capsulatus 11%）的生长表现与对照持平——个体重与增重为中间水平（ab），SGR 与 FCR 与对照无差异。28 天存活率各组一致（87 ± 4%，p > 0.05）。
与既有研究的定量对照
本研究是最早在较高蛋白替代水平（5–11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白）上做对虾投喂试验的工作之一。此前 Chumpol 等（2018）的替代水平只有 1.2–5.8，且生物量仅增长到初始体重的 8–12 倍，而本研究达到 33 倍。其它水产物种上已测试过更高替代率：Banerjee 等在尼罗罗非鱼上替代 40 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白，增重、存活与 SGR 均优于对照；Noparatnaraporn 等以 31% 替代水平投喂金鱼，SGR 与增重也更高。而 Delamare-Deboutteville 等用 PNSB 富集培养喂亚洲鲈鱼，替代到 21% 时表现与商业饲料相当，到 30% 时 SGR 与 FCR 反而变差；对虾投喂螺旋藻（Arthrospira）到 81 g 藻蛋白/100 g 饲料蛋白时也观察到同样的恶化。原文因此明确建议：对虾上应进一步探索 > 11% 的高替代水平，且 PNSB 作为水产饲料的研究应更多聚焦富集培养而不是纯培养。
关于生长改善的机制，原文承认由于该领域研究稀少，很难确定 FCR 与增重改善背后的机理，并给出四条并列假设：① 饲料中的 PNSB 可能定殖肠道协助消化——Chumpol 等曾观察到投喂活体 PNSB 的虾中 PNSB 可定殖胃肠道并分泌蛋白酶、脂肪酶与淀粉酶；本研究用的是冻干菌体，而补充材料显示这种干燥方式允许 PNSB 复活，因此饲料中的 PNSB 有可能参与了消化；② PNSB 会积累聚-β-羟基丁酸（PHB），已有研究证明该类化合物能提升对虾生长表现；③ PNSB 含维生素与色素，后者是抗氧化剂；④ 以上因素的共同作用。
Fig. 1 Percentage of growth rate reduction for (A) Vibrio parahaemolyticus TW01 and (B) V. campbellii LMG 21363 by supplementation of purple non-sulfur bacteria, a consortium of aerobic bacteria or a microalga. Microorganisms were grown photoheterotrophically (ph), chemoheterotrophically (ch) and photoautotrophically (pa). Error bars show confidence interval (CI; n = 3). The dotted line shows the average of Dunaliella salina because the results were statistically compared with this microalga.
图示信息上下两个柱状图，纵轴为病原菌生长速率下降百分比（%），刻度 0/25/50/75/100，误差棒为置信区间（n=3），柱上带 * 者表示显著高于或等于作为基准的杜氏盐藻（Dunaliella salina），图内还有一条水平虚线标出盐藻的平均水平。横轴为双层标签：上层是代谢型（ph 光异养、ch 化能异养、pa 光自养），下层是菌种——Rps. palustris、Rb. sphaeroides、Rb. capsulatus 各三个代谢型，Rsp. rubrum 与 A. marina 各两个代谢型，另有好氧异养菌群（ch）与 D. salina（pa）。(A) 针对副溶血弧菌 TW01，(B) 针对坎氏弧菌 LMG 21363。视觉上 (A) 柱高跨度极大（从接近 0 到接近 90），(B) 则多数集中在中等区间且下限明显更高。
论文结果冻干菌体（先用无水乙醇处理以阻止其生长）表现出前景：光异养培养的 Rps. palustris 对 V. parahaemolyticus TW01 造成最高的生长速率抑制 88 ± 2%；对 V. campbellii 而言，光自养培养的 Rps. palustris 抑制最强，达 80 ± 2%。代谢型对两株弧菌的抑制没有一致的作用（p > 0.05）。 总体上有效对抗两株病原的组合是：Rps. palustris（光异养）、Rb. capsulatus（化能异养与光自养）、Rsp. rubrum（化能异养）与 A. marina（化能异养）——这一判断由两株弧菌结果之间的皮尔逊相关检验支持（显著相关，p = 1.2 × 10⁻¹⁰），即某一 PNSB-代谢型组合若对一株病原抑制强，对另一株也强。作为参照的两组：合成啤酒废水上培养的好氧异养菌群把 TW01 与 V. campbellii 的生长速率分别降低 82 ± 4% 与 89 ± 1%（原文推测这一抑制可能来自培养基中 0.5 g/L 酵母带入的酿酒酵母痕量，已有文献显示其可影响 V. campbellii）；已知具抗菌潜力的微藻 D. salina 作为基准，抑制率为 55 ± 11%（TW01）与 57 ± 5%（V. campbellii），本文结果与文献一致。
研究意义这张图确立了 PNSB 具备内在的抗弧菌能力，且这一能力与生产方式无关——不论光异养、化能异养还是光自养培养出来的菌体，都能产生抗菌化合物。这对生产工艺是好消息：以废水产蛋白必然采用光异养培养，而该条件下 Rps. palustris 对 AHPND 病原 TW01 的抑制恰恰最强（88%）。但同一张图也要求谨慎：好氧异养菌群的抑制率同样高达 82%–89%，说明高抑制率并非 PNSB 独有；而原文指出目前对 PNSB 所产抗菌化合物的性质仍缺乏认识——不知其是否具种特异性甚至代谢型特异性，Chumpol 等（2019）对 Rb. sphaeroides 产细菌素的结构做了初步尝试，提示该化合物是含 NH₂ 基团的阳离子分子。
Fig. 2 Zone of inhibition resulting from purple non-sulfur bacteria on the growth of Vibrio parahaemolyticus TW01 and V. campbellii LMG 21363. No zones of inhibition were observed for Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum and Afifella marina. Purple non-sulfur bacteria were grown photoheterotrophic (ph), chemoheterotrophic (ch) and photoautotrophic (pa). Error bars show confidence interval (CI; n = 3).
图示信息柱状图，纵轴为抑菌圈大小（mm ± 置信区间），刻度 0/3/6/9/12；横轴双层标签，上层为代谢型 ph/ch/pa，下层为两个菌种 Rps. palustris 与 Rb. capsulatus；中间一条点划线把图分成左右两块，左侧为对 V. parahaemolyticus 的结果、右侧为对 V. campbellii 的结果，共 12 根柱。右侧各柱上方标有 a/ab/bc/c 显著性字母，左侧无字母标注（表明该侧组间差异不显著）。视觉上右侧 Rps. palustris 的 ph 与 pa 两根柱最高。
论文结果在 96 孔板试验之后进行的琼脂点样试验中，只有 Rb. capsulatus 与 Rps. palustris 抑制了弧菌生长；Rb. sphaeroides、Rsp. rubrum 与 A. marina 全部被病原菌覆盖生长（无抑菌圈）。与冻干菌体试验一致，代谢型不影响抑菌圈的大小。两组试验都显示 V. campbellii LMG 21363 比 V. parahaemolyticus TW01 更容易被抑制（冻干菌体 p = 0.02；活菌 p = 0.0002）。原文指出既有文献同样确认 Rb. capsulatus、Rps. palustris 与 Rb. sphaeroides 的某些菌株具抗菌性质；Chumpol 等（2017）从虾池分离 185 个 PNSB 菌株、筛出 10 株具抗弧菌潜力的菌株，分属 Rb. sphaeroides 与 A. marina。
研究意义活菌与冻干菌体两套试验的菌种谱不一致是这张图最重要的信息：Rsp. rubrum 与 A. marina 在 96 孔板中（化能异养）有 52%–66% 的抑制，但在琼脂上完全被病原盖住。这说明抑制效果强烈依赖投加形式与竞争环境——96 孔板是液相共培养、冻干菌体已被乙醇杀死（因此抑制来自菌体所含化合物而非活体竞争），琼脂点样则是活菌与病原在固相上直接争夺生长空间。对工程选种的启示是：若目标是把抑菌能力做成产品属性，Rps. palustris 与 Rb. capsulatus 是两个在两套试验里都稳定有效的候选；同时也提示不同筛选方法之间的结论不能互相替代。
Fig. 3 Shrimp survival for (A) the ammonia stress challenge and mortality rate for (B) Vibrio parahaemolyticus TW01 challenge and (C) V. campbellii LMG 21363 challenge after a feeding trial with a control feed and purple non-sulfur bacteria at two protein inclusion levels. *Negative control was shrimp fed with the control feed not exposed to ammonia stress or pathogens. Error bars show confidence interval (CI; n = 2 for ammonia stress and n = 3 for Vibrio challenge tests).
图示信息三个上下排列的子图，共用横轴——七列处理：未暴露的对照饲料（阴性对照，带 *）、对照饲料、Rps. palustris 纯培养 5% 与 11%、Rb. capsulatus 纯培养 5% 与 11%、Rb. capsulatus 富集培养 11%。(A) 纵轴为 48 h 存活率（% ± CI），刻度 0/25/50/75/100；(B)(C) 纵轴为死亡率（%·h⁻¹ ± CI），刻度 0/1/2/3。柱上标有 a/b/c 类显著性字母。视觉上 (A) 中未暴露阴性对照为 100%，对照饲料柱极低，而 Rps. palustris 两组柱明显高出一大截；(B) 各柱高度相近且误差区间大幅重叠、无字母标注；(C) 各柱高低交错并带字母。
论文结果(A) 氨氮胁迫结果最为突出：投喂 Rps. palustris 的虾在两个替代水平下 48 h 存活率都显著更高（63%–75%），而对照饲料仅 8%。原文的解释链条是：Rps. palustris 活体投入虾池已知能刺激免疫指标；据 Chen 等（2012），免疫指标在氨氮胁迫后会下降，但若事先由益生菌激发过则恢复更快——免疫指标更快恢复可能是 Rps. palustris 组存活率提高的原因。其余各饲料 48 h 存活率与商业饲料相当（p > 0.05），Rb. capsulatus 未观察到效果。(B) V. parahaemolyticus TW01 攻毒：虾受到严重影响，14 h 存活率约 62%，39 h 进一步降到 37%；各饲料之间死亡率无显著差异。(C) V. campbellii LMG 21363 攻毒：62 h 前无死亡，故追加一剂 10⁷ cells/mL；120 h 后所有处理存活率骤降至 0–40%；V. campbellii 的死亡率显著低于 V. parahaemolyticus TW01（p = 1.2 × 10⁻¹⁶）；死亡率最低的是 Rb. capsulatus 富集培养组，其次是对照饲料与 Rps. palustris 11%。
研究意义这张图给出了本文最诚实也最重要的一组判断。正面：Rps. palustris 让对虾在致死浓度氨氮下的 48 h 存活率从 8% 提到 63%–75%，这是一个数量级的差别，对高密度养殖中最常见的水质突变风险具有直接价值，也正是能把微生物蛋白从“成本更高的替代蛋白”变成“值得付溢价的功能性原料”的关键卖点。负面：体外 88% 的抑菌率没有换来体内保护——弧菌攻毒的死亡率与对照无异。原文据此推断，PNSB 可能只有在与病原直接接触时才能抑制弧菌（如体外试验的情形）；摄食消化 PNSB 能改善生长表现，但可能无法保护对虾免受弧菌侵害。基于这一推断，原文提出了具体的替代施用方案：把干燥 PNSB 做成独立纯颗粒、与饲料分开投喂，这样既能作为蛋白源被摄食，又能在水体中与弧菌直接作用；当然剂量与投喂频率仍需验证。此外要注意 (C) 图中部分 PNSB 组死亡率反而高于对照（Rps. palustris 5%、Rb. capsulatus 5% 与 11% 标为 a，对照为 b），说明在“弧菌 + 35 mg N/L 氨氮”的复合胁迫下 PNSB 并非一律有益。
机制讨论：营养、益生与抗菌三条互不重合的作用路径
- 营养路径（已验证）。 PNSB 菌粉粗蛋白 67.0%–73.7%（干基），替代豆粕/鱼粉至 5%–11% 蛋白水平后，对虾终末个体重、增重、SGR 与 FCR 相当或更优，存活率无差异。这条路径最扎实：至少在 11% 替代水平内，PNSB 是合格的蛋白原料。
- 促生长/益生路径（有假设、未直接证实）。 四条候选机制：肠道定殖并分泌蛋白酶/脂肪酶/淀粉酶助消化（本文使用冻干菌体，补充材料证明该方式允许 PNSB 复活）、PHB 积累提升对虾生长表现、维生素与色素（抗氧化剂）供给、以及上述因素的叠加。原文明确表示由于该方向研究稀少，机制难以确定。
- 抗逆路径（对氨氮已验证，且有种特异性）。 Rps. palustris 显著提升氨氮耐受（63%–75% vs 8%），Rb. capsulatus 无此效果。推测机制是免疫指标被预先激发后在胁迫后恢复更快。这一“种间差异”是本文一个可操作的结论——两个 PNSB 属种在生长表现上都不错，但抗逆附加价值只有 Rps. palustris 给出。
- 抗菌路径（体外成立、体内不成立）。 冻干菌体最高抑制 88%（TW01）与 80%（V. campbellii），活菌琼脂试验仅 Rps. palustris 与 Rb. capsulatus 有抑菌圈，代谢型不影响抑菌能力；但饲料中的 PNSB 未能降低攻毒死亡率。原文的解释是需要 PNSB 与病原直接接触，因此提出把 PNSB 做成独立颗粒投喂的方案。抗菌化合物本身的性质仍未明确。
体外结果不能外推到体内：本文给出的教科书式案例
96 孔板与琼脂平板显示 PNSB 强力抑制两株 AHPND 相关弧菌，任何只看体外数据的人都会推断“投喂 PNSB 能抗病”。而本文补上的体内攻毒试验直接否定了这一推断——死亡率各组无差异，甚至在复合胁迫下部分 PNSB 组死亡率更高。这提示专题内引用抗弧菌类文献时必须核实是体外筛选还是体内验证，以及 PNSB 是活体投池还是含在饲料中：原文指出 Chumpol 等（2017）把活体 PNSB 投入虾池确实改善了对 V. parahaemolyticus 的存活率，但活体投加不能作为对虾的蛋白源，两种用法的价值不可混算。
产业含义：从“替代蛋白”到“功能性原料”
本文的产业逻辑非常清晰：微生物蛋白的成本注定高于鱼粉（2 €/kg 蛋白）与豆粕（0.7 €/kg 蛋白），所以单靠“替代”无法成立商业模式，必须靠附加价值定价。本文交付的附加价值有两项被数据支持——更优的饲料系数（1.3–1.4 vs 1.7）与显著更强的氨氮耐受性（Rps. palustris，63%–75% vs 8%）；未被支持的是抗弧菌保护。
可用替代水平5–11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白已验证安全有效；更高水平（> 11%）在对虾上尚未测试，其它物种提示 21% 可行、30% 会变差
菌种选择生长表现：Rb. capsulatus 与 Rps. palustris 均可；抗氨氮附加价值：仅 Rps. palustris；抗菌能力（体外）：Rps. palustris 与 Rb. capsulatus 在两套试验中都稳定有效
培养方式富集培养（作为废水生产 PNSB 的替代物，含 14%–56% PNSB）在生长表现上与商业饲料持平，未显现优势；但其灰分仅 17.1% 远低于纯培养的约 36%，且在 V. campbellii 攻毒中死亡率最低——原文明确呼吁后续研究应更多聚焦富集培养而非纯培养
配方注意纯培养菌粉灰分高达约 36%，会挤占配方空间并影响钙磷平衡；Markwell 蛋白（约 48%）与粗蛋白（约 67%）口径差异大，配方计算需统一
加工方式冻干（48 h）后研磨、−20 ℃ 保存；该干燥方式允许 PNSB 复活，可能有助于肠道功能
替代施用方案原文建议把干燥 PNSB 做成与饲料分开的纯颗粒投喂，以同时获得蛋白价值与直接抑菌作用，但剂量与投喂频率有待验证
适用生产阶段本研究针对育苗/标粗阶段（起始 9.3 mg 的 PL10 后期幼体，28 天长到约 320–405 mg），原文结论也限定为“对虾育苗饲料”
对本专题而言，本文提供了两个可以反向指导上游工艺的信号。第一，产品端认可的是“富集培养”而非“纯培养”：原文明确指出既往 PNSB 蛋白原料研究全部用纯培养，只有 Delamare-Deboutteville 等最近才测试了富集培养，而未来研究应更多聚焦富集培养——这正好与用非灭菌真实废水生产 PNSB 的工程现实相吻合（废水生产是非无菌的，必然得到富集培养而非纯培养）。第二，灰分是一个被低估的质量指标：上游若能降低菌体灰分（本文富集培养 17.1% vs 纯培养约 36%），在饲料配方中的可用空间会显著变大。
结论层面，本文确认对虾饲料中加入 PNSB 可获得相当甚至更优的生长表现，投喂 Rps. palustris 的虾对氨氮胁迫更耐受，冻干与活体投加的 PNSB 都能抑制 V. parahaemolyticus TW01 与 V. campbellii LMG 21363 的生长且与代谢型无关；同时明确指出要充分发挥其健康促进潜力，还需更多研究以及可能改变 PNSB 的施用方式。原文最后强调这条路线能促进循环经济，因为 PNSB 可以在回收或可再生资源（例如废水）上培养。
适用场景
- 对虾育苗/标粗阶段饲料配方开发：可在 5–11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白的水平上替代豆粕与/或鱼粉，预期获得相当或更优的个体重与饲料系数。
- 以“功能性原料”而非“廉价替代蛋白”定位 PNSB 菌粉的商业论证——本文提供了 FCR 改善（1.3–1.4 vs 1.7）与氨氮耐受性提升（63%–75% vs 8%）两项可定价的数据。
- 菌种筛选：需要抗氨氮附加价值时优先 Rhodopseudomonas palustris；需要体外抑菌能力时 Rps. palustris 与 Rhodobacter capsulatus 在液相与固相两套试验中均稳定有效。
- 以废水/回收资源生产 PNSB 的项目做下游价值论证：本文是少数在较高替代水平上完成对虾投喂 + 抗逆 + 攻毒 + 体外筛选完整链条的研究，可作为下游端证据引用。
- 上游工艺的质量目标设定：把降低菌体灰分（纯培养约 36% vs 富集培养 17.1%）与提高蛋白含量并列为菌粉质量指标。
不适用 / 需谨慎的场景
- 不能据此宣称投喂 PNSB 可以防控 AHPND 或弧菌病——体内攻毒试验明确显示死亡率与对照无差异，且复合胁迫下部分 PNSB 组更差。
- 不能外推到 > 11% 的高蛋白替代水平：本文未测试，其它物种的证据提示 30% 时表现会变差。
- 不适用于对虾养成期或其它养殖物种的直接配方决策——本文仅 28 天、仅育苗/标粗阶段、仅南美白对虾。
- 不能把“活体 PNSB 投池”的抗病文献与本文的“饲料中含 PNSB”混为一谈：活体投加不能作为蛋白源，两种用法的收益不可叠加计算。
- 不适合作经济性判断：本文未做成本核算，仅指出微生物蛋白成本高于鱼粉与豆粕这一前提。
- 以纯培养菌粉为基础的配方需注意灰分（约 36%）与钙磷平衡问题，不宜直接照搬到高矿物添加的配方体系。
局限与不确定性
- 蛋白替代水平偏低且未探边界：仅测试 5 与 11 g PNSB 蛋白/100 g 饲料蛋白，原文自身明确呼吁探索 > 11% 的水平。其它物种的证据提示 21% 可行、30% 会使 SGR 与 FCR 变差，对虾的上限尚不清楚。
- 部分处理组重复数很低：Rb. capsulatus 纯培养 11% 组仅 n = 2、5% 组 n = 3，而该组恰是“个体重高出 25%、FCR 1.3”这一亮点结论的来源，统计效力有限。氨氮胁迫试验也只有 2 个重复（共 16 尾）。
- 配方并非单一变量：11% 替代组不仅加入 PNSB，还把豆粕由 38.0 降到约 17.1、鱼粉由 20.0 升到约 27.6、小麦粉由 31.0 升到约 39.0；Rb. capsulatus 11% 组实测粗蛋白 46.76 g/100 g DW 明显高于其余各组的 37.8–39.8，因此该组的生长优势不能全部归因于 PNSB 本身。
- 促生长机制未验证：肠道定殖助消化、PHB、维生素与色素等四条解释都是假设，本文没有测定肠道菌群、消化酶活性、PHB 含量或抗氧化指标。
- 体外抗菌未能在体内兑现：投喂 PNSB 未降低弧菌攻毒死亡率；在 V. campbellii 加 35 mg N/L 氨氮的复合胁迫下，部分 PNSB 组死亡率反而显著高于对照。原文提出的“独立颗粒分开投喂”方案尚未验证，剂量与频率亦未确定。
- 抗菌化合物性质不明：原文明确指出目前仍缺乏对 PNSB 所产抗菌化合物性质的认识，不知其是否具种特异性或代谢型特异性；同一试验中好氧异养菌群的抑制率（82%–89%）与 PNSB 相当甚至更高，且原文推测其效果可能来自培养基带入的酵母痕量。
- “富集培养”不是真的废水产物：它是在同一 VFA 合成培养基的跑道池反应器中生产的、作为废水生产 PNSB 的替代物（PNSB 占 14%–56%），与真实废水培养的菌体在成分、卫生指标与批间波动上仍可能不同。
- 试验周期与阶段有限：只有 28 天、只针对育苗/标粗阶段（9.3 mg 长到约 320–405 mg），未涉及养成期表现、肉质、色泽或长期安全性；也未做成本与经济性核算。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性原文补充材料（S1–S5，含跑道池反应器运行与群落组成、每周个体重、合成啤酒废水培养基组成、LC50 拟合、冻干 PNSB 复活验证）通过出版社页面提供，链接为 https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2020.735788；正文未见独立的数据仓库可用性声明。
代码可用性原文未提供独立代码仓库；统计分析在 R 3.4.1 + RStudio 中完成，LC50 拟合使用 Excel（Microsoft Office Professional Plus 2016），饲料配方使用 AMS Software 的 Mevoblend 软件。
经费来源原文致谢段明确列出：① 佛兰德研究基金会（FWO-Vlaanderen）资助第一作者 A.A. 的博士研究员岗位（战略基础研究，1S23018N）；② 安特卫普大学 Rosa Blanckaert 基金遗赠给 A.A. 的研究经费；③ 比利时科学政策办公室对 MELiSSA 的支持（CCN5 to C4000109802/13/NL/CP），即欧空局生命保障系统研发计划，为本研究提供了科学与后勤支持。
利益冲突原文有明确的利益冲突声明：作者声明不存在已知的、可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
来源与链接
图片来源：本文为 Elsevier 订阅期刊论文，原文 Fig. 1–3 与 Table 1–3 按学术评述引用方式复用，版权归 Elsevier 及作者所有，来源见 DOI: 10.1016/j.aquaculture.2020.735788。