文献信息
英文题名
New approach for raw biogas: Production of single cell protein by sulfide-tolerant methane-oxidizing bacteria consortia
作者
Hai-Ming Huang, Zhi-Xin Xue, Yu-Feng Jiang, Rui Li, Rong-Bo Guo, Xiao-Lei Fan, Shan-Fei Fu
期刊 / 年份
Chemical Engineering Journal 2024
DOI
10.1016/j.cej.2024.153678
卷期 / 页码
Vol. 495, 153678
单位
青岛大学化学化工学院；中国科学院青岛生物能源与过程研究所（山东省沼气生产与利用工业工程实验室等）；山东能源研究院；青岛新能源山东省实验室；大连洁净能源国家实验室
一句话概括：通过在培养基中添加 0–20.00 mg/L Na2S（等效 0–2973 ppmv H2S）从稻田土壤中定向富集耐硫 MOB 菌群，比较其与纯培养优势菌 M. parvus OBBP 在生物量、蛋白质含量与氨基酸组成上的差异，并用共现网络解析菌群中与 MOB 正相关的伴生菌。
一图不看也要知道的几件事
- 富集实验设 4 组：M（不加 Na2S）、MS-L（2.19 mg/L Na2S，等效 326 ppmv H2S）、MS-M（10.00 mg/L，等效 1486 ppmv H2S）、MS-H（20.00 mg/L，等效 2973 ppmv H2S），每组三个重复，共富集六代、历时约 60 天。
- 培养基为硝盐矿质盐培养基（NMS），顶空为 CH4:O2 = 2:3（v/v）混合气；M. parvus OBBP 纯培养顶空为 CH4:O2 = 1:2。
- 富集驯化中随代数增加，亚培养周期从第一代仅 5 天延长到第六代 18 天；所有 Na2S 组呈现相同现象。
- 15 代分组 M 的 MOB 总丰度 1.712%、MS-L 升至 2.744%、MS-H 进一步升至 3.660%，说明 MOB 丰度随 Na2S 浓度升高而增加。
- 门水平上 Proteobacteria 从 M 到 MS-H 依次为 52.41%、63.67%、70.28%；Verrucomicrobia 为 0.20%、1.78%、4.38%；Bacteroidetes 则由 45.67%、32.43% 降至 23.14%。
- 属水平上 M. parvus OBBP 为各组共同优势 MOB；20.00 mg/L Na2S 时 Methylocystis 丰度升至 3.345%，成为主导 MOB；Methylosarcina 对硫化物高度敏感（第三代曾达 10.609%，第五代降至 0.032%）。
- 硫氧化细菌（SOB）在加硫组富集：MS-L 中 Thermomonas 占 8.324%、Enterobacter 占 18.211%；MS-H 中 Thermomonas 占 16.517%、Enterobacter 占 4.836%。
- M. parvus OBBP 纯培养在 20.00 mg/L Na2S 下的生长与不加 Na2S 组相似，表明该菌自身可耐受 20.00 mg/L Na2S。
- 菌群最大生物量 1.516 ± 0.187 g/L（MS-H）、蛋白含量 56.10% ± 10.99%；MS-L 生物量 1.339 ± 0.049 g/L（与 M 组无显著差异，p>0.05）、MS-M 为 1.411 ± 0.146 g/L；M、MS-L、MS-M、MS-H 蛋白含量分别为 55.43%、54.02%、55.67%、56.10%。
- 纯培养 M. parvus OBBP 最大生物量仅 0.818 ± 0.106 g/L、蛋白含量 37.12% ± 7.40%；且随 Na2S 浓度升高蛋白含量明显下降而生物量变化微小，提示 Na2S 抑制其蛋白合成。
- 总氨基酸含量：M 0.560 g/L、MS-L 0.499 g/L、MS-M 0.418 g/L、MS-H 0.385 g/L；共检出 17 种氨基酸，其中 8 种为必需氨基酸。
- 加硫菌群的含硫氨基酸比例（7.49–9.72%）高于不加硫菌群（6.13%）；MS-L 的胱氨酸比例最高为 8.22%，约为 M 组（4.88%）的两倍。
- PDCAAS 以蛋氨酸为限制性氨基酸，MS-L 得分最高为 0.446，低于鱼粉但高于大豆。
研究背景与要解决的问题
预计 2050 年全球人口接近 100 亿，蛋白质需求持续增长，而传统农业与畜牧产蛋白方式占地广、温室气体排放大、不可持续，亟需高效的新型蛋白来源。
单细胞蛋白（SCP）以微生物生物质作为食物或饲料蛋白来源，具有生长快、蛋白含量高的优势；好氧甲烷氧化菌（MOB）蛋白含量高于真菌与酵母、细胞壁比藻类更易消化，已由 Calysta（FeedKind®）与 Unibio（Uniprotein®）实现商业化生产，但原料目前多为天然气。
厌氧消化产生的沼气是更绿色的甲烷来源。原始沼气含 40–75% CH4、15–60% CO2，以及 0–1% H2S 等杂质；H2S 是弱酸，易透过细胞膜并结合细胞色素 C 氧化酶抑制好氧呼吸，1,000 ppmv H2S 即可明显抑制 Methylocapsa acidiphila。若能用耐硫菌群直接利用原始沼气，就可省去昂贵的沼气提纯步骤。
MOB 在自然界常与其它微生物共存；硫氧化细菌（SOB）可将 H2S 氧化为 S 与硫酸盐，理论上可支撑 MOB 耐受更高 H2S 浓度，而 MOB 可为 SOB 提供 CO2 或有机代谢物，但环境中是否存在耐硫 MOB 以及 H2S 对耐硫菌群氨基酸代谢的影响此前研究很少。
概念与技术边界
MOB（甲烷氧化菌）
以甲烷为唯一碳源与能源进行好氧代谢的细菌，也称甲烷营养菌，可将 CH4 转化为细胞生物质，是生产 SCP 的候选菌。
SCP（单细胞蛋白）
以微生物细胞本身作为食物或饲料蛋白来源，因生长快、蛋白含量高被视为未来蛋白的重要补充。
Na2S 添加当量 H2S
实验通过向液体培养基加入 Na2S，经由溶解态 H2S 解离平衡提供硫化物，其浓度换算为顶空等效 H2S ppmv 值（如 20.00 mg/L ≈ 2973 ppmv）。
SOB（硫氧化细菌）
能把还原态硫（如 H2S）氧化为单质硫和硫酸盐的细菌，可缓解硫化物毒害，与 MOB 形成互惠。
PDCAAS
蛋白质消化率校正氨基酸评分，以限制性氨基酸相对参考蛋白的比例乘以粪便真消化率，FAO 推荐的蛋白质量评价方法。
体系与方法
| 环节 | 做法与参数 |
|---|---|
| 菌群富集 | 取 5 g 稻田表层土加入 300 mL 血清瓶，用 45 mL 无菌 NMS 培养基充分悬浮并密封；分别加入 0、2.19、10.00、20.00 mg/L Na2S 形成 M、MS-L、MS-M、MS-H 四组，各三重复；顶空为 CH4:O2=2:3，150 rpm、30 ℃ 恒温摇床培养，约 60 天完成富集。 |
| 纯培养对照 | Methylocystis parvus OBBP（由中科院东北地理与农业生态研究所提供）接种于 50 mL NMS 培养基，顶空 CH4:O2=1:2，设 OBBP、OBBP-L、OBBP-M、OBBP-H 四组各三重复，用 UV-2600 于 600 nm 测 OD600 跟踪生长。 |
| 气体分析 | 定期取样，用 GC-7860 plus 气相色谱（TCD 检测器、氩气载气、GDX-502 填充柱）测定顶空 CH4 与 CO2 浓度。 |
| 群落分析 | 取 M−3、M、MS-L、MS-M、MS-H 及原始土壤样品，进行 16S rRNA V3–V4 区高通量测序（Illumina MiSeq/NovaSeq）；用 R(v3.6.0)/QIIME(v1.8.0) 做物种组成、α 多样性与 Spearman 相关网络分析（筛除 p>0.05 且 |R|<0.6 的边）。 |
| 生物量与蛋白测定 | 培养液 10,000 rpm 离心 10 min、去离子水洗两次后 −20 ℃ 保存；−80 ℃ 冷冻干燥得干重（DCW）；蛋白用 BCA 试剂盒测定。 |
| 氨基酸与评分 | 按 GB 5009.124–2016 用氨基酸分析仪测定酸水解氨基酸与含硫氨基酸；采用 FAO FN Paper 92 (2011) 参考氨基酸标准计算 PDCAAS，细菌、大豆、鱼粉的粪便真消化率分别取 0.99、0.95、0.97。 |
主要结果（原文图表逐条解读）
图示信息：两幅折线图：(a) CH4 含量(%)–时间(d，0–65)，横轴按“第1–6代”以虚线分隔，四条曲线为 M（黑方块）、MS-L（红圆）、MS-M（蓝三角）、MS-H（绿倒三角）；(b) 对应的 CO2 含量(%)–时间。
论文结果：每代 CH4 从约 35–40% 开始下降至约 0–5%，CO2 从近 0 上升至约 17–22%，形成反复的锯齿状累积/重置模式；1–5 代 CH4 消耗很快，第 6 代明显变慢，M 组下降最快、MS-H 保持最高最久，最终各组均收敛至约 4%。不同 Na2S 浓度组之间的 CH4 消耗速率在各代基本相同。
研究意义：首次接种即无滞后期、各组消耗速率一致，说明原始接种物本身具有较高的硫化物适应能力或含有大量耐硫 MOB；随传代出现的消耗变慢与菌群结构变化及有机物耗尽相关。
图示信息：堆叠柱状图，横轴样品为 soil、M−3、M、MS-L、MS-H；纵轴为相对丰度(%)。门水平显示 Proteobacteria、Bacteroidota、Verrucomicrobiota 等；属水平含 Terrimonas、Thermomonas、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Enterobacter 等大量属。
论文结果：随 Na2S 浓度升高，Proteobacteria 由 52.41%（M）升至 70.28%（MS-H），Verrucomicrobia 由 0.20% 升至 4.38%，Bacteroidetes 由 45.67% 降至 23.14%；所有已鉴定的好氧 MOB 均属于 Proteobacteria 与 Verrucomicrobia。属水平上 M、MS-L、MS-H 富集 Terrimonas、Thermomonas、根瘤菌类群与 Enterobacter 等，MS-L 属组成最为多样。
研究意义：硫化物添加改变了群落结构并富集了可能与 MOB 互作的伴生菌（尤其是具硫氧化能力的 Thermomonas、Enterobacter），为构建人工耐硫菌群提供候选名单。
图示信息：表格：行为 MOB 属（Methylocystis、Methylomagnum、Methyloterricola、Crenothrix、Methylococcus、Methylomonas、Methylocaldum、Methylosarcina、Methylomicrobium、Methylobacter），列为 soil、M−3、M、MS-L、MS-H 的丰度。
论文结果：Methylocystis 由土壤 0.106% 经 M−3 0.496%、M 1.402%、MS-L 1.240% 升至 MS-H 3.345%，成为主导 MOB；Methylosarcina 由 M−3 的 10.609% 降至 MS-H 0.007%；Methylobacter 与 Methylomicrobium 在第五代样品中未检出；MOB 总丰度由 M 的 1.712%、MS-L 的 2.744% 升至 MS-H 的 3.660%。
研究意义：不同 MOB 属对 Na2S 的耐受程度差异显著：Methylocystis 可耐受高浓度硫化物，Methylosarcina 即便低浓度也受抑制，说明“选菌”是耐硫菌群构建的核心。
图示信息：OD600（纵轴 0–2.0）–时间（d，0–7）折线图，四条曲线分别为 0、2.19、10.0、20.0 mg Na2S/L，带误差棒。
论文结果：所有培养自 OD600≈0 起增长；0 mg/L 对照组早期增长最快（第 3.5 天约 1.5、第 5 天约 1.8）；加 Na2S 组初期滞后（20 mg/L 组截至第 3.5 天最低），但到第 5–6 天追平；第 5 天后各曲线趋于平台（OD600 约 1.6–1.85），20 mg/L 组在终点仍处于较高水平。
研究意义：M. parvus OBBP 自身可耐受 20.00 mg/L Na2S；与 M. capsulatus Bath（H2S 超过 5000 ppmv 才明显受抑制）和 M. acidiphila（超过 1000 ppmv 即受明显抑制）相比，不同 MOB 菌株的硫化物耐受差异很大。
图示信息：两幅柱状图，横轴分别为 M/MS-L/MS-M/MS-H 与 OBBP/OBBP-L/OBBP-M/OBBP-H；绿柱=干生物量、橙柱=蛋白质，纵轴为 Weight(mg/L)。
论文结果：(a) 菌群干生物量由 M 约 1320 mg/L 依次升至 MS-L 约 1340、MS-M 约 1410、MS-H 约 1510 mg/L，蛋白同向升高（约 720、710、780、850 mg/L）。(b) 纯培养干生物量在四组间基本恒定（约 800–825 mg/L），但蛋白随处理强度显著下降（约 315、230、120、100 mg/L）。
研究意义：加硫后菌群的生物量与蛋白产量均优于纯培养，MS-H 在不牺牲生物量与蛋白含量的前提下可耐受 20.00 mg/L Na2S；而 Na2S 会抑制纯培养 M. parvus OBBP 的蛋白合成，说明菌群中伴生菌对蛋白积累有重要贡献。
图示信息：2×2 环形图（M、MS-L、MS-M、MS-H），右侧图例含 17 种氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸）。
论文结果：各组中谷氨酸占比最大（约 9.3–10.2%），其次天冬氨酸（约 8.0–9.2%）；蛋氨酸（约 1.2–1.5%）与异亮氨酸（约 2.4–2.7%）占比最低。MS-L 的胱氨酸占比最高（8.22%），MS-M 为 6.14%，MS-H 为 6.85%，M 为 4.88%（另有组氨酸在 M 为 3.81%、MS-L 为 3.41%、MS-M 为 3.63%、MS-H 为 5.18%）。加硫菌群含硫氨基酸比例 7.49–9.72%，高于不加硫菌群的 6.13%。
研究意义：低浓度 Na2S 似乎促进含硫氨基酸合成，H2S 的存在的确在一定程度上影响氨基酸组成；但菌群总氨基酸含量随 Na2S 升高而下降（0.560→0.385 g/L），提示硫化物对总氨基酸积累存在权衡。
图示信息：热图：行为蛋氨酸、异亮氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸与 PDCAAS；列为 M、MS-L、MS-M、MS-H、Fishmeal、Soybean；色标 0.230（深蓝）至 3.120（深红）。
论文结果：最大值为鱼粉的赖氨酸 3.116；苏氨酸在 M、MS-L 与鱼粉中较高（约 1.724–2.023）；组氨酸在 M(1.803)、MS-H(1.504)、MS-L(1.411) 较高。PDCAAS 行在 M、MS-L、MS-M、MS-H 与大豆中分别等于其蛋氨酸值（0.411、0.446、0.310、0.236、0.293），而鱼粉的 PDCAAS 为 0.748（对应组氨酸）——表明 M/MS 组与大豆的限制性氨基酸为蛋氨酸，鱼粉为组氨酸。
研究意义：耐硫 MOB 菌群蛋白质量与大豆相当、低于鱼粉；MS-L 得分最高（0.446），说明低硫化物添加量对蛋白营养品质更有利，高硫（MS-H）反而使 PDCAAS 降至 0.236。
图示信息：属水平共现网络图，节点按门着色：蓝色=Proteobacteria（Pseudoxanthomonas、Hyphomicrobium、Hydrogenophaga、Acinetobacter、Enterobacter、Thermomonas、Methylocystis、Methylosarcina 等）、青色=Bdellovibrionota、洋红=Verrucomicrobiota（Prosthecobacter）、绿色=Firmicutes（Bacillus）、鲑红=Bacteroidota（Terrimonas、Edaphobaculum 等）。
论文结果：Ciceribacter、Edaphobaculum、Prosthecobacter、Pseudoxanthomonas 及 Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 与 M. parvus 呈正相关，被判定为其重要伴生菌；其中 Ciceribacter 与根瘤菌类群同属 Rhizobiaceae（具固氮能力的兼性厌氧菌）。Methylosarcina lacus 与 Bacillus、Acinetobacter、Methylotenera 正相关，而与 Enterobacter、Thermomonas 负相关——后者具硫氧化能力且在高 Na2S 下富集，而 Methylosarcina 对硫化物敏感，故呈负相关。
研究意义：网络分析给出了可用于人工构建耐硫菌群的伴生菌清单；由于环境菌群存在病原菌与毒性代谢物等食品安全风险，作者倾向以人工构建菌群替代直接使用环境富集菌群生产食用蛋白。
机制小结
- SOB 将 H2S/Na2S 氧化为单质硫与硫酸盐，降低硫化物对 MOB 细胞色素 C 氧化酶的抑制，从而提升整个菌群的硫化物耐受上限。
- MOB 在氧化 CH4 过程中产生的 CO2 与有机代谢物可供 SOB 利用，形成 MOB–SOB 互惠（H2S 氧化由 SOB 承担，MOB 获得脱毒保护）。
- 菌群中的异养菌可通过去除毒性代谢物（甲醇、甲醛）或提供必需代谢物（如钴胺素）刺激 MOB 生长；本研究中 MOB 总丰度随 Na2S 升高而增加，显示群落互作提升了耐硫表现。
- H2S 作为硫源可影响含硫氨基酸代谢：低浓度 Na2S 促进胱氨酸等含硫氨基酸合成，但高浓度下总氨基酸含量与 PDCAAS 下降，体现硫化物胁迫对氨基酸代谢的双向作用。
工程与产业含义
- 耐硫 MOB 菌群可直接处理含 H2S 的原始沼气生产 SCP，跳过昂贵的沼气提纯（脱硫）环节，降低原料预处理成本。
- 菌群方式优于纯培养：在不牺牲生物量与蛋白含量的前提下可耐受 20.00 mg/L Na2S（等效 2973 ppmv H2S），且生物量（1.516 g/L）与蛋白（56.10%）均高于 M. parvus OBBP 纯培养（0.818 g/L、37.12%）。
- 鉴于环境富集菌群存在病原菌与潜在毒性代谢物的食品安全风险，作者建议以网络分析识别的正相关伴生菌（Ciceribacter、Edaphobaculum、Prosthecobacter、Pseudoxanthomonas、根瘤菌类群）为依据人工构建生产菌群。
- 亚培养周期随传代由 5 天延长至 18 天，且 MOB 总丰度随传代下降，提示连续传代的菌群稳定性与传质（致密絮体阻碍气液传质）是放大需要解决的问题。
适用与不适用场景
✅ 适用场景
- 含 H2S 杂质、拟直接利用的原始沼气/生物气产单细胞蛋白或饲料蛋白
- 需要免脱硫预处理以降低成本的甲烷生物转化工艺
- 以菌群而非纯菌实现耐硫、耐冲击的甲烷氧化体系设计与人工菌群构建参考
⚠️ 不适用 / 需谨慎
- 需要直接食品级安全的蛋白生产（环境富集菌群存在病原菌与毒性代谢物风险，需人工构建菌群）
- 高浓度 H2S 场景需谨慎：不同 MOB 耐受差异大，M. acidiphila 在 >1000 ppmv H2S 即受明显抑制
- 以蛋氨酸含量为关键指标的优质蛋白替代（本体系限制性氨基酸为蛋氨酸，PDCAAS 最高仅 0.446，低于鱼粉）
局限与不确定性
作者未解决 / 需要读者注意的问题
- 研究为血清瓶批式小试（300 mL），未进行反应器放大与连续运行验证。
- 纯培养 M. parvus OBBP 的生物量为 0.818 ± 0.106 g/L，与菌群 1.516 g/L 的比较未在完全相同气相比（2:3 vs 1:2）下进行。
- 群落分析仅取第五代样品，MOB 丰度在传代中的持续下降可能影响终期结论的代表性。
- 未直接以真实原始沼气（含其它杂质）为气源，而是以 Na2S 添加模拟 H2S 胁迫。
- PDCAAS 计算所依赖的粪便真消化率取文献值（细菌 0.99），非本研究实测。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性声明为“Data will be made available on request”；作者声明无利益冲突；资助来源为青岛新能源山东省实验室开放课题（QNESL OP202311）与泰山学者计划；作者致谢贾仲君教授提供 Methylocystis parvus OBBP。
来源与链接
- 原文（Chemical Engineering Journal, 2024, 495:153678） — https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.153678