文献信息
一图不看也要知道的几件事
- 最适 pH 为 8.0,最高 DCW 1.8 g/L;96 h 时 SCP 达 0.8 g/L;超过 120 h 后细胞死亡致 PQQ 浓度下降。
- NH4+-N 6 与 8 g/L 均促进生长与 SCP 合成且无显著差异,8 g/L 最利于 PQQ 合成,菌株可耐受 10 g/L NH4+-N。
- 最适 C/N 比为 3.9,此时 SCP 与 PQQ 分别为 2 g/L 与 19.2 mg/L;所有条件下总糖在 68 h 内耗尽。
- MB(糖蜜+沼液)培养基中总糖 68 h 内耗尽,MAS(甲醇+硫酸铵)中甲醇至 92 h 才耗尽,MB 的 DCW 与 SCP 显著更高。
- 5 L 罐补料分批:补碳 4 次(48、76、90、102 h),120 h 时 SCP 达 17.6 g/L。
- 接种量 15% 时 120 h SCP 达 21.3 g/L;PQQ 最高产量出现在接种量 10%。
- 恒定溶氧 50% 时 SCP 最高 28.1 g/L;PQQ 的最适溶氧为 30%,低溶氧显著抑制 PQQ 合成。
- 两段式供氧(0–72 h 50% DO;72–168 h 30% DO)使 SCP 与 PQQ 分别提高至 35.6 g/L 与 235.1 mg/L。
- SCP 总氨基酸含量 40.6%,其中谷氨酸 9.6%、酪氨酸 6.3% 最高;核酸含量 7.8%。
- 菌体含 PQQ 8.7 mg/L,且 K 与 P 含量分别为 16537.6 与 6524.6 mg/kg;Hg、Pb 未检出。
研究背景与要解决的问题
人口扩张(预计 21 世纪中叶达 80–100 亿)威胁粮食供给,动植物蛋白生产周期长、需占用大量耕地与水并造成污染。源自真菌、藻类与细菌的单细胞蛋白(SCP)生产周期短、占地小、受气候影响小,2021 年欧盟已批准其作动物饲料。
目前 SCP 生产多用一碳微生物(尤其甲基营养菌),其蛋白含量高于真菌、细胞壁比藻类更易消化;但甲醇价格高、有毒需专用储运设备、且微生物对甲醇耐受差,制约了高效增殖。糖蜜作为制糖副产物价格低廉、含糖可达 50%,是替代碳源。
氮源成本同样制约商业化。沼液是厌氧消化的主要副产物,富含氨基酸与 N、P、K,其氨氮约占总氮的 60%,是低成本氮源,且含乙醇、乙酸等可生物降解碳化合物,可提升发酵效率。
脱氮生丝微菌(H. denitrificans)是兼性甲基营养菌,可利用多碳化合物与无机氮,且已被广泛用于生产高值辅酶吡咯喹啉醌(PQQ),产量可达 1.5 g/L。以糖蜜与沼液发酵可在回收养分的同时联产 SCP 与 PQQ,提升整体经济价值。
概念与技术边界
体系与方法
| 环节 | 做法与参数 |
|---|---|
| 菌株与原料 | 野生型 H. denitrificans SSWJ1(GenBank PP486182);甘蔗糖蜜含蔗糖 39.8%、葡萄糖 3.5%、果糖 3.1%(江苏某糖厂);沼液含 0.8% NH4+-N、pH 8.1(浙江某沼气厂)。沼液 TN 8.1 g/L、TP 1.5 g/L、TK 4.7 g/L、乙酸 1.1 g/L、丙酸 2.8 g/L、乙醇 1.2 g/L;糖蜜 TN 7.2 g/L、TOC 238.7 g/L、COD 843.5 g/L、蔗糖 397.5 g/kg。 |
| 培养基与种子 | MB 培养基以糖蜜为碳源、沼液为氮源(初始 10 g/L 蔗糖、2 g/L NH4+-N);MAS 培养基每升含 CH3OH 10 g、4 g (NH4)2SO4、3 g Na2HPO4、1.5 g KH2PO4、1 g MgSO4·7H2O 及 10 mL 微量元素液。种子在 30 ℃、200 rpm 培养,按 5% 接种量转接。 |
| 摇瓶条件优化 | 考察 pH 6.5–8.5(原文图注列出 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、NH4+-N 2–10 g/L、C/N 2、3.1、3.9、4.5 对菌体生长与 SCP、PQQ 合成的影响。 |
| 5 L 罐补料分批 | 通气量 150 L/h,30 ℃,pH 用氨水维持在 7.0;总糖降至 5 g/L 以下时补加稀释糖蜜至初始水平,共补 4 次(48、76、90、102 h)。发酵 48 h 后补加甲醇使浓度约维持 1 g/L 以促进 PQQ 合成;并考察接种量与溶氧(DO)的影响。 |
| SCP 与产物测定 | TC、pH、TS、COD 按既定方法测定;NH4+-N 用分光光度计于 420 nm 测定;菌体 TN 用凯氏定氮仪,SCP 含量为 TN×6.25;还原糖用 DNS 法,蔗糖用 HPLC。PQQ 用荧光法(激发 380 nm/发射 480 nm,检出限 0.25 µg/L)与 HPLC 法(C18-PAQ 柱,50 mM 乙酸铵/乙酸 70:30,1.0 mL/min,330 nm,检出限 350 µg/L)测定,并用 UPLC-Q-TOF-MS 验证。 |
| 品质评价与统计 | 核酸于 260 nm 测定;冻干后水解,用氨基酸分析仪测氨基酸组成;重金属用 ICP 测定。所有实验三次重复,用 SPSS 单因素方差分析,p<0.05 为显著。 |
主要结果(原文图表逐条解读)
机制小结
- 偏碱条件(pH 8)下甲基营养菌细胞膜上甲醇脱氢酶活性最高,底物氧化高效,促进细胞增殖与产物合成。
- PQQ 的合成受氧的双重影响:PqqE 属自由基 SAM 酶、对氧敏感需低氧条件,PqqC 作为氧化酶利用氧参与四步氧化,二者需求相反,故 30% DO 最有利于 PQQ。
- SCP 合成依赖菌体生长,而 PQQ 属稳定期合成的次级代谢产物,两者在时间与溶氧需求上分离,为两段式策略提供依据。
- 培养基中的氨基酸等亲核物质会与 PQQ 反应生成失活的噁唑类化合物,导致糖蜜/沼液体系的 PQQ 低于纯甲醇体系。
- 菌株基因组含额外的 PQQ 依赖型糖脱氢酶,使其能有效氧化糖类;甲醇脱氢酶底物谱宽,使其可利用乙醇、乙酸、丙酸等复杂碳源。
工程与产业含义
- 以糖蜜替代甲醇、沼液替代硫酸铵,原料价格约为甲醇的 36%,在原料占 SCP 总成本约 60% 的前提下可降低近 60% 成本。
- 沼液含约 60% 总氮为氨氮,可直接作氮源并实现氨氮与 K、P 的回收;SSWJ1 可耐受 10 g/L NH4+-N。
- 5 L 罐运行条件:通气量 150 L/h、30 ℃、pH 7.0(氨水调控);总糖降至 5 g/L 以下时补料,48 h 后补甲醇维持约 1 g/L。
- 溶氧采用两段式控制(0–72 h 50%、72–168 h 30%)可同时提高 SCP 与 PQQ 产量至 35.6 g/L 与 235.1 mg/L,SCP 生产效率 0.3 g/L/h(约为单一 SCP 生产最高效率的 80%)。
- 联产的 SCP 含 PQQ 8.7 mg/L,达到中国蛋鸡饲料添加剂推荐量(1–3 mg/kg)的需求,提升产品附加值。
适用与不适用场景
- 以糖蜜等廉价糖源为碳源、以沼液等富氨氮废水/消化液为氮源的 SCP 与 PQQ 共产发酵。
- 需要同时回收废水中氨氮、钾与磷的资源化场景。
- 甲基营养菌(H. denitrificans)为生产菌株、且可直接使用野生型菌株的批次与补料分批发酵。
- 以甲醇为唯一碳源追求 PQQ 最高滴度:本研究糖蜜/沼液体系的 PQQ 低于甲醇体系(文献甲醇体系最高 1.5 g/L)。
- 需要极低核酸含量的人类食用蛋白:本 SCP 核酸含量 7.8%,需额外处理。
- 对含硫氨基酸需求高的饲料配方:该 SCP 的蛋氨酸略低于 FAO/WHO 推荐值。
- 直接外推到工业规模:本研究在 5 L 罐中完成,未做中试与放大验证。
局限与不确定性
- 实验主体为摇瓶与 5 L 发酵罐,未经中试和工业规模验证。
- 溶氧影响仅以体积百分比表示,未给出实际的 kLa 或氧传递速率,放大时难以直接换算。
- SCP 含量按总氮×6.25 折算,属近似估算,可能高估;核酸含量 7.8% 的去除工艺仅提出思路未验证。
- PQQ 在糖蜜/沼液体系中因亲核物质反应而损失,作者只给出机理解释,未提供抑制该反应的定量策略。
- 发酵液中 PQQ 的纯化回收方法未被优化。
- 产物品质评价缺少动物消化率试验,仅为体外成分与标准比对。
数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突
数据可用性:"Data will be made available on request"(应要求提供)。利益冲突:作者声明无已知竞争性经济利益或个人关系。经费:轻工技术与工程国家一流学科项目(LITE2018-11),并获江南大学工业生物技术教育部重点实验室与碳水化合物化学与生物技术教育部重点实验室资助。补充材料见 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2025.132809。
来源与链接
- ScienceDirect 原文 — https://doi.org/10.1016/j.biortech.2025.132809