沼液培养光合细菌把蛋白含量推到 90%：盐度与高氨氮胁迫的双因子解析

文献信息

一图不看也要知道的几件事

• 以畜禽场沼液（NH₃-N 2350 mg/L、C/N 0.184、盐度 1.38%）为培养基，光合细菌（photosynthetic bacteria, PSB）的蛋白含量 96 h 后达到 86%，在暗好氧条件下最高达 91.86%，远高于既有微生物蛋白报道值。
• 同时实现部分水质净化：NH₃-N 去除率 73.3%，高于该极低 C/N 比条件下常规生物处理方法所能达到的水平；但生物量基本不变，维持 200–300 mg/L。
• 暗好氧优于光厌氧：两种光氧条件下蛋白含量都高，但暗好氧显著更好，原因被归为暗好氧下 PSB 进行氧化磷酸化，NH₃-N 被更充分地用于蛋白合成。
• 四个候选原因逐一排查后的结论是：高盐度胁迫是主因（加盐啤酒废水的蛋白含量由 55% 升至 82.68%），高氨氮是次要原因（加氨的啤酒废水与发酵液仅达 69.84% 与 65.64%），极低 C/N 不是原因（补碳解除 C/N 胁迫后蛋白含量仍从 54% 升到 92%）。
• 沼液的复杂组成本身构成缓冲体系：氨氮与盐度同时加入啤酒废水时，PSB 生物量迅速下降、蛋白含量在 24 h 达 88% 后快速回落；而沼液高碱度（11 471.12 mg/L）提供了有利的碱性环境。

研究背景与要解决的问题

微生物蛋白（单细胞蛋白，single cell protein, SCP）富含必需氨基酸，被广泛用作食品与饲料的替代来源，也是高效的叶面肥、饵料、饲料与发泡剂。SCP 的另一个吸引力在于微生物的高生产效率与培养的灵活性。用于 SCP 生产的常见物种是酵母、真菌、藻类与光合细菌（photosynthetic bacteria, PSB），其中 PSB 备受关注：生长速率较高、细胞蛋白含量高（约 45%–65%）、细胞壁更易消化，对 SCP 生产价值很高。

问题在于成本。常用培养基是麦麸培养基与豆浸培养基，两者的 NH₃-N 含量为 545–1 550 mg/L，但人工培养基成本高、操作复杂。为把成本压到最低，可以用含各种营养物的废水替代。既有研究已尝试在乳清发酵液、大豆废水与市政污水中培养 PSB，得到的菌体不仅富含高品质蛋白，还含辅酶 Q10、5-氨基乙酰丙酸与类胡萝卜素等有益物质。用废水作 SCP 生产培养基的优势是三重的：积累有价值物质、最小化生产成本、同时削减污染物。

更进一步的观察是：不同成分与特性的废水可能刺激有价值组分的产生。原文列举了三条依据——市政污水中污泥的聚羟基丁酸酯达到 40%；合适的盐度胁迫提高 PSB 的类胡萝卜素与细菌叶绿素含量；尤其是在高 NH₃-N 的沼液中，PSB 的蛋白含量达到 60%–70%。这最后一条来自同组前期工作（Yang et al., 2017），也是本文的直接起点。

因此本文的目标很明确：用高氨氮浓度（> 2000 mg/L）的沼液把 PSB 的蛋白含量进一步提高，测试关键影响因子，并基于沼液特性分析高氨氮、高盐度、二者联合以及极低 C/N 比这四个候选原因，最后探究蛋白的潜在生物合成机制。

体系与方法

分析方法：每天取 5 mL 样品，11 000 rpm 离心 10 min 取上清测 NH₃-N 与 COD。NH₃-N 用纳氏试剂法（TU-1900 分光光度计，北京普析通用），COD 按 APHA 标准方法。收集的 PSB 用于测定生物量与蛋白含量，生物量按 Lu et al. (2011) 的方法。为避免沼液带入的残留蛋白干扰，收集的菌体在测定前先用去离子水洗涤。蛋白用测定盒按 Lowry 法测定。盐度用盐度计（DDSJ-308F，上海仪电科学仪器）。谷氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶活性按 Jo et al. (2012) 的方法测定。所有化学试剂来自国药集团化学试剂有限公司。每个报告值为三次或以上实验数据的平均值。

主要结果（含原文图解读）

Fig. 1 Protein content of PSB in biogas slurry (a) and comparison with protein content of other microorganisms (b); Effects of light-oxygen conditions (c) and initial concentration of biogas slurry (d) on protein content of PSB (Not diluted biogas slurry: COD 465.8 mg/L, NH3-N 2348.93 mg/L, salinity 1.38 g/100 g).

图示信息四联图，纵轴统一为 Protein content (mg/mg)，量程 0.0–1.0、间隔 0.2。(a) 单序列实心方块折线，横轴 Time (h) 刻度 0/24/48/72/96：从约 0.53 起，24 h 到 0.75，48 h 达约 0.88 的峰，72 h 与 96 h 维持 0.85–0.86，误差棒约 ±0.01–0.03。(b) 为分类对比图，横轴类别依次为 PSB (This study)（实心柱）、Yeast、Other fungus、Algae、other PSB（斜纹区间框）：本研究单值 0.86，酵母区间 0.40–0.60，其他真菌 0.20–0.50，藻类 0.40–0.70，其他 PSB 0.45–0.65。(c) 两序列：空心圆为 Light-anaerobic、实心方块为 Dark-aerobic；暗好氧由 0.51 单调升至 24 h 的 0.83、48 h 的 0.91、72 h 的 0.91、96 h 的 0.92；光厌氧由 0.54 升至 48 h 的 0.80、72 h 的 0.81，96 h 回落到 0.73。(d) 五序列（不稀释/稀释 2、5、10、20 倍），横轴 0/24/48/72：不稀释组由 0.51 持续升至 0.91（误差棒最大约 ±0.04）；稀释 2 倍升至约 0.655；稀释 5 倍升至约 0.57；稀释 10 倍与 20 倍基本持平或略降（约 0.50 与 0.44）。

论文结果(a) 96 h 后 PSB 蛋白含量达到 86%，高于其他微生物的常规蛋白含量；多数报道中 PSB 蛋白含量约为 45%–65%。同期生物量基本不变、维持 200–300 mg/L，原因是 C/N 比极低且不适宜；NH₃-N 去除率达 73.3%，高于此类低 C/N 比废水的常规生物处理方法。(b) 汇总了各类用于 SCP 生产的微生物的蛋白含量报道值，对比可见本研究获得的 PSB 蛋白含量显著更高。(c) 两种经典光氧条件下蛋白含量都高，但暗好氧更优，最高达 91.86%，远高于所有其他微生物；原因可能是 PSB 在暗好氧下进行氧化磷酸化，NH₃-N 被更充分地用于蛋白合成。(d) 不同初始沼液浓度下蛋白含量差异很大：未稀释组超过 90%，而稀释 2、5、10、20 倍各组的终点蛋白含量都低于 65%。这清楚说明沼液中的某些物质刺激了蛋白积累，且初始浓度越高强化效果越好。

研究意义四个面板合起来给出了本文最核心的工程判断：要把蛋白含量做到极高，条件是“不稀释 + 暗好氧”，而这两个条件都与直觉相反——通常处理高氨氮废水会先稀释以降低毒性，通常培养光合细菌会给光照并维持厌氧。(a) 与 (d) 同时暴露了本路线的根本代价：生物量几乎不长（200–300 mg/L），所以“蛋白含量 90%”是含量而非产量的成就。真正的产品意义要看 mg/L 级的蛋白浓度，而在生物量不增长的前提下，蛋白浓度的提升空间是有限的。

Fig. 2 Variety of protein content of PSB in high-ammonia wastewaters (a), in high-salinity wastewaters (b) and variety of protein content and biomass of PSB during biogas slurry treatment when initial COD/TN ratio of slurry was 4 (c).

图示信息三个纵置面板。(a) 横轴 Time (h) 0–96、纵轴 Protein content (mg/mg) 0.0–1.0，四序列：实心方块为 Biogas slurry、空心菱形为 Brewery wastewater + ammonia (2000 mg/L)、实心菱形为 Fermentation liquor + ammonia (2000 mg/L)、空心圆虚线为 Control group。全部自 0.51–0.53 起：沼液组 24 h 跃至 0.83、48 h 约 0.91（误差棒最大 ±0.05）、96 h 约 0.92，为最高曲线；加氨啤酒废水缓慢升至 96 h 的约 0.70；加氨发酵液先降到 0.47 再回升至 96 h 的约 0.65；对照组从 0.51 单调微降至 0.47。(b) 坐标同 (a)，三序列：实心方块为 Biogas slurry、实心星为 Brewery wastewater + salinity (1.38 g/100 g)、空心圆虚线为 Control group。两处理组在 24 h 同时跃至 0.83–0.84 几近重合，随后沼液组升至 0.90/0.91/0.92，加盐组维持 0.85/0.85 并在 96 h 略降至 0.83；对照组由 0.52 缓降至 0.47。(c) 双轴图：左轴 Protein content (mg/mg) 0.0–1.0、右轴 Biomass (mg/L) 100–600，实心方块折线为蛋白含量、斜纹柱为生物量。蛋白含量由 0.53 单调升至 0.75（24 h）、0.82（48 h）、0.95（72 h）、0.97（96 h）；生物量由约 370 mg/L 降至 24 h 的约 310，48 h 回到约 375，72 h 达峰约 535，96 h 略降至约 520。

论文结果(a) 为了厘清 NH₃-N 的作用，向啤酒废水与发酵液这两种废水中各加入 2 000 mg/L 氨。两种高氨废水中 PSB 蛋白含量仅略有提高，终点分别为 69.84% 与 65.64%。与沼液中的结果相比，结论是高氨氮浓度是蛋白强化的一个原因，但不是主因。(b) 沼液盐度为 1.38%。向啤酒废水中加 NaCl 后，PSB 蛋白含量由 55% 升至 82.68%。机制解释是高盐度显著提高 PSB 的脱氢酶活性，从而增加 NADPH 的产生，而 NADPH 有利于氨基酸的生物合成。结论是高盐度的胁迫效应在蛋白强化中起主要作用，但不是全部原因。(c) 为检验极低 C/N 比是否为胁迫来源（常规微生物需要高得多的 C/N，4–20），向沼液中额外添加碳源把初始 COD/TN 提到 4 以解除低 C/N 压力。结果显示解除该胁迫后蛋白含量仍从 54% 升到 92%，说明极低 C/N 比对蛋白含量的提高没有贡献。同时可见补碳后生物量确实上升（72 h 达峰约 535 mg/L），说明碳源是生物量的限制因子。

研究意义这组图完成了因子分解，逻辑链清晰：加氨只能到约 70%（辅因）→ 加盐能到约 83%（主因）→ 但沼液能到约 92%，说明还有沼液特有的因素 → 补碳解除 C/N 胁迫后仍达 92%，排除 C/N → 剩下的解释是沼液的复杂组成本身提供了缓冲体系。工程上最有用的信息在 (c)：补碳可以同时保住高蛋白含量并把生物量从 200–300 拉到 500 mg/L 以上，这直接回应了 Fig. 1 暴露的“含量高但产量低”问题，虽然作者的本意只是做胁迫排除实验。

第三个对照实验是氨氮与盐度的联合效应，用同时添加氨与盐的啤酒废水完成。结果显示 PSB 在这种废水中不能良好生长、生物量快速下降；蛋白含量在 24 h 从 55% 升到 88%，随后快速回落。作者的解释是：啤酒废水高度可生物降解，因此生物量的急剧下降可能是因为盐度与 NH₃-N 的联合胁迫在像啤酒废水这样成分简单的培养基中超过了 PSB 的阈值，PSB 细胞死亡导致蛋白快速分解。另一方面，沼液成分复杂，为 PSB 抵抗并适应这些胁迫提供了缓冲体系；此外该沼液的碱度很高（11 471.12 mg/L），为 PSB 提供了有利的碱性环境。

机制：氨同化两步走与两个关键酶

作为氨基酸的主导氮源，NH₃-N 在微生物的蛋白生物合成中起非常重要的作用。原文指出 NH₃-N 参与的氨基酸生物合成有两条概念通路：

1. 第一条利用通路：微生物在谷氨酸合成酶（glutamate synthase）催化下，直接用 α-酮戊二酸与 NH₄⁺ 生成谷氨酸。
2. 第二条利用通路：在谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）催化下，用谷氨酸与 NH₄⁺ 生成谷氨酰胺；随后在转氨酶催化下，谷氨酰胺转氨生成其他氨基酸，而这些氨基酸是蛋白合成的前体物质。

基于上述分析，谷氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶是把无机氮转化为有机氮的最重要的两个酶，因此本文测定了它们的活性。结果显示在 0–24 h 期间，谷氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶的活性分别提高了 26.55% 与 46.95%。酶活升高说明沼液处理过程中谷氨酸与谷氨酰胺的生物合成得到了强化，与前述理论分析一致。更细致的一点是顺序：在谷氨酸合成酶活性上升之后，谷氨酰胺合成酶的活性仍持续上升到 24 h，这与谷氨酸、谷氨酰胺生物合成的先后顺序相符。

把这条酶学证据与盐度胁迫串起来，机制链条是完整的：高盐度显著提高 PSB 的脱氢酶活性 → NADPH 产生增加 → 有利于氨基酸生物合成；同时高 NH₃-N 一方面为 PSB 细胞生长与蛋白合成提供充足氮源、并在光合作用中可作为氢供体，另一方面过高的 NH₃-N 对微生物有毒性，因而产生胁迫效应、刺激功能蛋白的合成以抵抗胁迫。两条作用叠加，最终体现为谷氨酸/谷氨酰胺合成通路的活性上调与蛋白含量的极高积累。

另需注意暗好氧优于光厌氧的机制解释：PSB 在暗好氧下进行氧化磷酸化，NH₃-N 在这一代谢模式下被更充分地利用于蛋白合成。这与常规认知形成有趣的对照——PSB 通常被视为光异养微生物，但在“最大化蛋白含量”这一目标下，放弃光照而改用曝气反而是更优选择。原文引用 Lu et al. (2011) 指出光氧条件是影响 PSB 两条代谢通路的重要因子，不同代谢通路对蛋白生物合成有明显不同的影响。

工程与产业含义

本文提供的是一条“负价值原料 → 高蛋白含量产品”的路径：畜禽场沼液属于处理难度大的废水（NH₃-N 超过 2 000 mg/L、C/N 仅 0.184），常规生物处理在这种碳氮比下几乎无法有效脱氮；而本工艺在同一批反应中既把 NH₃-N 去除 73.3%，又把菌体蛋白含量做到 90% 以上。这种“治污与产品同步”的属性正是 PSB 路线的核心吸引力。

• 不要稀释高浓度沼液。 这是最反直觉也最直接可用的操作结论：未稀释组蛋白含量超过 90%，稀释 2–20 倍各组都低于 65%。稀释既增加水量又损失产品品质。
• 暗好氧比光厌氧更适合以蛋白为目标的运行模式。 蛋白含量最高值 91.86% 出现在暗好氧，且光厌氧在 96 h 出现回落（0.81 → 0.73）。暗好氧还免去了光照设施与光穿透的约束，这对处理不透光的深色沼液尤其重要。
• 碳源是产量的钥匙，不是含量的钥匙。 补碳把 COD/TN 提到 4 之后，蛋白含量仍达 92%，而生物量从约 370 升到 72 h 的约 535 mg/L。也就是说“高含量”与“高产量”并不冲突，缺的只是碳源。以蛋白浓度（mg/L）为目标时，沼液配碳共处理是值得优先评估的方向。
• 基质缓冲能力是前提。 沼液的高碱度（11 471.12 mg/L）与复杂组成让 PSB 得以在双重胁迫下存活并适应。把同样的胁迫强度施加到成分简单的废水上会导致菌体死亡与蛋白分解。

把本文放在专题的整体图景里，它标出了 PSB 蛋白含量的经验上限区间。原文汇总的对照是：酵母 0.40–0.60、其他真菌 0.20–0.50、藻类 0.40–0.70、其他 PSB 报道 0.45–0.65，而本研究达到 0.86–0.92。这个数字之所以重要，是因为它把“PSB 蛋白含量 60% 左右”这个业内常规印象的天花板抬高了一大截，并说明抬高的路径不是菌株改良而是基质胁迫设计。与光调控路线相比，本文的手段更廉价（不需要闪光调制设备，甚至不需要灯），但代价是必须接受生物量增长受限，或额外补碳。

还有一点值得注意：作者反复强调用废水作培养基可同时积累有价值物质，而 PSB 菌体除蛋白外还含辅酶 Q10、5-氨基乙酰丙酸与类胡萝卜素等。既然高盐度胁迫已被证明可同时提高类胡萝卜素与细菌叶绿素含量（原文引用的 Wang et al., 2017），那么盐度胁迫在原理上可能是一个“多产物同向调控”的操作杠杆——但本文并未测定这些副产物，属于有待验证的推论。

适用场景

• 高氨氮、低 C/N 的畜禽场沼液处理，且希望同步获得高蛋白含量菌体的场景。
• 以“最大化菌体蛋白含量”为首要目标、可接受较低生物量浓度的小规模高值化工艺。
• 无法提供有效光照（如深色不透光废水、无照明预算）而考虑暗好氧 PSB 培养的项目。
• 需要理解盐度/氨氮胁迫如何影响微生物蛋白积累的机制研究，或以此设计胁迫强化策略的实验室工作。

不适用 / 需谨慎的场景

• 以蛋白体积产率（mg/L·d 或 g/L）为核心 KPI 的项目：本文条件下生物量仅 200–300 mg/L，不补碳时产量很低。
• 基质成分简单、缓冲能力弱的废水（如高可生物降解性的啤酒废水）：同等强度的盐度 + 氨氮联合胁迫会超过 PSB 阈值，导致菌体死亡与蛋白分解。
• 需要稀释高浓度废水的既有工艺流程：本文结论恰恰是不稀释效果最好，与常规稀释降毒的操作习惯冲突。
• 以类胡萝卜素等光依赖型色素为主产品的工艺：本文最优条件为暗好氧无光照，与色素生产的光需求方向相反。
• 直接用于人用食品或需要完整安全性数据的饲料注册：本文未提供氨基酸组成、核酸含量、重金属与病原体等数据，且原料为畜禽场沼液。

局限与不确定性

• 生物量几乎不增长：未补碳时生物量仅维持 200–300 mg/L，原因是沼液的 C/N 极低且不适宜。因此“90% 蛋白含量”是含量指标，原文未给出蛋白体积浓度（mg/L）或蛋白产率，无法据此判断经济性。
• 短通讯篇幅有限、数据颗粒度粗：只有 2 张可提取数据图加 1 张通路图；多组对照实验（加氨、加盐、加氨加盐）只报告了蛋白含量，未同时给出对应的生物量、COD 与 NH₃-N 去除数据，因此“胁迫是否损害处理效果”无法评估。
• Lowry 法在高色素菌体中的适用性未讨论：PSB 富含类胡萝卜素与细菌叶绿素，Lowry 法测蛋白可能受干扰。原文虽然用去离子水洗涤菌体以排除沼液带入的残留蛋白，但未讨论色素对显色的影响，也未用凯氏定氮等方法交叉验证。
• 单一沼液样品、单一菌株：仅使用山东某畜牧场提供的一批沼液与一株池塘分离的 Rhodopseudomonas，缺乏不同来源沼液（季节、饲喂方式、发酵工艺差异）与不同菌株的重复验证。
• 机制层面为理论分析加两个酶活：作者自述蛋白生物合成机制是“根据理论分析”探讨的，实验证据仅为谷氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶在 0–24 h 的活性变化幅度，没有转录组、蛋白组或代谢流数据支撑，也未测脱氢酶活性或 NADPH 水平（后者是盐度作用机制的关键环节，仅引自文献）。
• 未评估产品安全性与氨基酸组成：全文未给出氨基酸谱、核酸含量、重金属或病原体检测数据。沼液源于畜禽场，作为饲料原料使用前这些指标是必须的。

数据 · 代码 · 经费 · 利益冲突

来源与链接

图片来源：本文为 Elsevier 订阅期刊论文，原文 Fig. 1–2 按学术评述引用方式复用，版权归 Elsevier 及作者所有，来源见 DOI: 10.1016/j.biortech.2017.08.109。